HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷的影響研究

鄧秋菊，李慧穎，向琳

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織缺血后，恢復(fù)組織血液流通加重了缺血性損傷，其與心肌梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑燃膊“l(fā)生有關(guān)，心肌缺血再灌注損傷伴隨有心肌細(xì)胞氧化損傷、細(xì)胞過(guò)度凋亡等病理學(xué)變化[1,2]。高遷移率蛋白1（HMGB1）是一種染色體結(jié)合蛋白，其在染色體結(jié)構(gòu)維持、基因的轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中具有重要作用。當(dāng)組織受到損傷后，HMGB1可作為一種警報(bào)素從壞死細(xì)胞、應(yīng)激細(xì)胞、活化的免疫細(xì)胞等中被釋放出來(lái)，參與心肌損傷[3,4]。研究顯示，HMGB1參與糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注、心肌肥大等疾病的發(fā)生，心肌細(xì)胞可以釋放HMGB1，參與心肌組織疾病的發(fā)生[5-7]。本研究通過(guò)構(gòu)建缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型，研究缺氧復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞釋放HMGB1的影響，通過(guò)小RNA干擾技術(shù)下調(diào)心肌細(xì)胞中HMGB1的合成，研究HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC；HMGB1siRNA和siRNA control購(gòu)自英國(guó)Abbexa；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen；HMGB1、GAPDH引物由南京金斯瑞合成；qRT-PCR和cDNA合成試劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo；丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma；乳酸脫氫酶（LDH）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物；超氧化物歧化酶（SOD）含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO；HMGB1含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海西唐生物；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved Caspase-9）抗體購(gòu)自美國(guó)CTS。

1.2 缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型構(gòu)建H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中。缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建：H9C2細(xì)胞密度約為60%時(shí)，用移液槍把培養(yǎng)液吸除以后，再添加不含血清的DMEM，把細(xì)胞放在95%N2、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12 h。取出培養(yǎng)板，把原來(lái)的培養(yǎng)液倒掉，換成10%胎牛血清的DMEM，把細(xì)胞放置于95%空氣、5% CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧約4 h，即為缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組H9C2細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度約為70%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取HMGB1 siRNA和siRNA control各5 μl分別與5μl的Lipofectamine 2000混合后，再與250 μl的Opti-MEM混合稀釋。在室溫中結(jié)合5 min后，添加到6孔板中，培養(yǎng)6 h后，把細(xì)胞培養(yǎng)液換成是含有10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。H9C2細(xì)胞分為正常組、模型組、陰性組、干擾組。轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA和siRNA control后的心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧復(fù)氧處理以后分別記為干擾組和陰性組，以不做轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后記為模型組，以正常培養(yǎng)不做任何處理的心肌細(xì)胞記為正常組。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細(xì)胞按照上述方法處理以后，提取細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定提取的RNA OD260 nm/OD280 nm介于1.8～2.0之間。取各組RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，分兩步擴(kuò)增，95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s×40個(gè)循環(huán)。以GAPDH把對(duì)照進(jìn)行歸一，用2-△△Ct法計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄水平。引物：GAPDH 上游 5，-TCCACCACCCTGTTGGTG TTA-3’，下游 5，-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3’。

HMGB1上游5，-CGGAGTCAACGGATTTGGT CGTAT-3’，下游5，-AGCCTTCTCCATGGTGGT GAAGAC-3’。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ELISA測(cè)定細(xì)胞分泌HMGB1水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法測(cè)定各組培養(yǎng)液上清中HMGB1含量，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞中MDA、SOD水平和培養(yǎng)液中LDH水平測(cè)定正常組、模型組、陰性組、干擾組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清和各組細(xì)胞，用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD含量，用二硝基苯肼顯色法檢測(cè)上清中LDH，步驟分別參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡正常組、模型組、陰性組、干擾組細(xì)胞在按照上述方法處理以后，加入胰蛋白酶消化以后，1000 g離心10 min，把上清吸除以后，添加500 μl的Binding buffer，再添加10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，重復(fù)3次。

1.8 Western blot測(cè)定Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平正常組、模型組、陰性組、干擾組細(xì)胞在按照上述方法處理后，PBS洗滌各組心肌細(xì)胞并加入預(yù)冷的裂解緩沖液，在冰上裂解30 min后離心取上清，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行10% SDSPAGE電泳，上樣量體積含20 μg蛋白。電泳結(jié)束后，將目的膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，洗膜，室溫孵育稀釋好的Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9及內(nèi)參GAPDH抗體（均為1:800稀釋?zhuān)? h，洗膜，加入二抗，室溫孵育1.5 h。ECL顯色液避光顯色，掃描圖像，以GAPDH的灰度值為內(nèi)參，分析各蛋白水平，重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析用SPSS 21.0軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，多組差異比較均用單因素方差分析，組間比較均用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞合成HMGB1水平模型組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平與模型組相比沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HMGB1含量和細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 敲低HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷影響模型組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細(xì)胞中MDA水平明顯高于正常組，SOD水平明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細(xì)胞中MDA水平、SOD水平與模型組相比沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平和細(xì)胞中MDA水平明顯低于模型組，SOD水平明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 敲低HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡影響模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細(xì)胞凋亡率與模型組相比沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、表3）。

表1 各組細(xì)胞HMGB1合成水平（±s）

表1 各組細(xì)胞HMGB1合成水平（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 上清液中HMGB1含量（ng/106個(gè)細(xì)胞） 細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA正常組 1.90±0.17 1.00模型組 3.32±0.32a 2.97±0.24a陰性組 3.41±0.36b 2.99±0.28b干擾組 2.37±0.29c 1.86±0.14c

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平及細(xì)胞中MDA、SOD水平（±s）

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平及細(xì)胞中MDA、SOD水平（±s）

注：LDH：乳酸脫氫酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 LDH水平（U/L） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）正常組 514.25±65.87 6.27±0.52 124.36±10.28模型組 982.47±66.82a 14.68±1.47a 64.17±8.93a陰性組 986.73±74.29b 14.97±1.75b 65.31±9.68b干擾組 768.92±51.03c 8.64±0.71c 87.25±7.36c

2.4 敲低HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平影響模型組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平與模型組相比沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。干擾組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2、表4）。

3 討論

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定下調(diào)HMGB1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡影響

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率（±s）

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 凋亡率（%）正常組 4.32±0.08模型組 38.25±3.21a陰性組 39.12±4.67b干擾組 22.76±2.85c

圖2 Western blot測(cè)定下調(diào)HMGB1對(duì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白影響

表4 各組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平（±s）

表4 各組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＞0.05；與模型組相比，cP＜0.05

組別 Cleaved Caspase-3 Bax Cleaved Caspase-9正常組 0.46±0.05 0.35±0.03 0.12±0.02模型組 0.84±0.09a 0.76±0.08a 0.71±0.05a陰性組 0.83±0.07b 0.75±0.07b 0.70±0.06b干擾組 0.67±0.06c 0.43±0.06c 0.52±0.08c

HMGB1蛋白由215個(gè)氨基酸組成，屬于非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可以通過(guò)核小體與DNA結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8,9]。HMGB1在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外都具有調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能的作用，其可被損傷的細(xì)胞釋放至細(xì)胞外，調(diào)控組織炎癥[10]，在胃腸道相關(guān)炎癥、心肌炎等方面具有重要作用。近年來(lái)的研究顯示，HMGB1參與心肌缺血再灌注損傷，在心肌缺血再灌注損傷模型中表達(dá)上調(diào)[11]。高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中HMGB1的合成和分泌，并且參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷過(guò)程[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平升高，細(xì)胞分泌的HMGB1水平也升高，說(shuō)明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞合成和分泌HMGB1，這與上述報(bào)道相一致。

心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致原本存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH被泄漏到細(xì)胞外[13]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物，檢測(cè)其表達(dá)水平的高低可以間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷程度[14]。細(xì)胞內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的維持與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化和氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，SOD是目前發(fā)現(xiàn)的氧自由基的頭號(hào)天敵，可降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，減輕氧化損傷[15,16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞中MDA合成水平升高，細(xì)胞內(nèi)的SOD水平降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平升高，說(shuō)明成功構(gòu)建了缺氧復(fù)氧氧化損傷模型，敲低HMGB1可以降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞合成MDA，提高SOD水平，減少LDH的釋放，減少氧化損傷。

Caspase蛋白家族在通常情況下以沒(méi)有活性的酶原方式存在于細(xì)胞內(nèi)，在受到凋亡信號(hào)刺激后可被激活。激活途徑有兩種，一種是死亡受體途徑，一種是線(xiàn)粒體途徑，死亡受體途徑主要是通過(guò)細(xì)胞之間的死亡配基之間的結(jié)合引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，線(xiàn)粒體途徑是以線(xiàn)粒體為核心激活細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)Bax的表達(dá)，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17,18]。Caspase-3和Caspase-9分別為Caspase凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子和起始因子，在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中過(guò)度激活[19,20]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧可以通過(guò)Caspase-3、Caspase-9激活和促進(jìn)Bax表達(dá)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而敲低HMGB1可以通過(guò)降低Caspase-3、Caspase-9的活化水平和抑制Bax的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞中HMGB1合成和分泌水平升高，而敲低HMGB1可以減弱缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，減少Caspase-3、Caspase-9、Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)于HMGB1在原代心肌細(xì)胞和其他心肌細(xì)胞株中的作用仍然需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果明確了HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡中的作用，缺氧復(fù)氧心肌損傷發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，以后會(huì)繼續(xù)探討HMGB1在缺氧復(fù)氧心肌損傷炎癥反應(yīng)和鈣離子超載中的作用。