miR-98通過調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷抑制動脈粥樣硬化形成的作用機(jī)制研究

劉繼紅，馮斌

動脈粥樣硬化（AS）引起的慢性炎癥反應(yīng)是冠心病、腦卒中、心力衰竭等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，如何有效防治AS的發(fā)生和發(fā)展，是全球醫(yī)學(xué)界長期關(guān)注并亟待解決的重大難題[1]。AS的發(fā)病機(jī)制與多種調(diào)控因子和病理過程密切相關(guān)，包括內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤、氧化應(yīng)激等[2]。微小核糖核酸（miR-98）是一類生物作用巨大的、非編碼的小RNA，參與了大量基因或信號通路的調(diào)控作用，在心血管疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要生物學(xué)效應(yīng)[3]。其中miRNA-98是發(fā)現(xiàn)較早的一類miRNA，屬于let-7家族成員，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，通過作用于多種抑癌因子，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和凋亡等過程[4]。但是目前關(guān)于miR-98與AS發(fā)病機(jī)制的研究探討尚少。血管內(nèi)皮損傷學(xué)說認(rèn)為，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是引起血管內(nèi)皮損傷的主要參與因子，在凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的作用下，低密度脂蛋白被修飾成為ox-LDL，刺激單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化并形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，最終導(dǎo)致脂質(zhì)斑塊的形成[5]。因此通過抑制LOX-1的表達(dá)，降低ox-LDL引發(fā)的血管內(nèi)皮損傷，可能為臨床治療AS的藥物研發(fā)提供新的潛在靶點。有研究通過生物信息學(xué)預(yù)測系統(tǒng)，認(rèn)為miR-98可與LOX-13’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制LOX-1的表達(dá)[6]。本項研究通過探討miR-98血管內(nèi)皮損傷中的調(diào)控作用以及可能的作用機(jī)制，為AS分子治療提供新的靶點和選擇?，F(xiàn)研究報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料來源

1.1.1 受試細(xì)胞人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）和人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMC）來源于American Type Culture Collection（ATCC）細(xì)胞庫。

1.1.2 受試動物野生型C57BL/6小鼠8只，清潔級，4～6周齡，22～25g，由北京維通利華實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于本單位SPF級動物房內(nèi)。

1.1.3 實驗對象及分組選取2017年3月～2017年10月于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的AS患者60例，其中男性37例，女性23例，年齡48～82（64.08±10.24）歲；另外選擇同一時期在我院體檢中心進(jìn)行健康體檢的正常受試者20例作為健康對照組，其中男性10例，女性10例，年齡，年齡45～80（62.55±10.87）歲。

1.2 主要試劑ox-LDL（TBARs 90 nmol MDA/mg），Alfar Aesar公司；miR-98模擬物和抑制物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自中國博士德生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒、real-time PCR試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒，購自美國OMEGA生物公司；細(xì)胞核因子κB （NF-κB p16）抗體和內(nèi)皮素-1（ET-1）抗體，購自美國Abcam公司；LOX-1單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司；β-actin多克隆抗體購自中國博士德生物工程有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基、血管細(xì)胞培養(yǎng)基，購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液（0.25%），購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；FBS胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗，購自美國Thermo Fisher公司；Trizol，購自美國Invitrogen公司；DEPC，購自美國Sigma公司；30% H2O2，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯仿、異丙醇、無水乙醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器GTR16-2型高速臺式冷凍離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司；5810R型臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf；JB-CJ-1500FX超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；實時定量PCR儀，美國MJ Research公司；UV-8000紫外分光光度計，上海精密儀器儀表公司；iMake多功能酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad公司；CX41倒置光學(xué)顯微鏡和OLS4100激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯；電子分析天平，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；Amersham電泳儀，瑞典Bioscience；恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽，北京六一儀器廠；FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)，美國ProteinSimple。

1.4 血液樣本采集采集所有受試者空腹血液樣本5 ml，置于血液采集管中，室溫靜置1 h后，低速離心，加入50 ml 0.1%無菌焦炭酸二乙酯溶液，混勻后，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清LOX-1含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）測定外周血LOX-1含量，按照LOX-1 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)將HAEC細(xì)胞或HAMSC細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的血管細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。

1.7 提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向5只野生型C57BL/6小鼠腹腔注射3 ml 3%巰基乙醇酸鈉，3 d后頸椎脫臼將小鼠處死，向小鼠腹腔中注射5 ml預(yù)冷的無菌PBS緩沖液，5 min后采用無菌注射器將腹腔液抽出，放置5 ml無菌離心管中，低速離心，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液重懸，再次離心，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞和培養(yǎng)液移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24～48 h。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 MTT法檢測ox-LDL對HAMSC細(xì)胞、HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖的影響將HAEC細(xì)胞或巨噬細(xì)胞（1×103個/孔）單層接種到96孔板中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置8個平行孔，每組分別加入不同終濃度的ox-LDL（0、5、15、45、135 μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振動器上震動5 min，置于顯微鏡下觀察無紫色結(jié)晶物。將96孔板放置于450酶標(biāo)儀上，檢測波長為570 nm，參比波長為450 nm處的吸光光度值（OD值），計算平均值。

1.9 ox-LDL干預(yù)實驗將HAEC細(xì)胞、HASMC細(xì)胞或巨噬細(xì)胞（5×105個/孔）分別單層接種到6孔板中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后，每組分別加入不同終濃度的ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，分別提取RNA或蛋白，備用。

1.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)染提前1 d在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6孔板上接種5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，融合率達(dá)到50%～60%，在不同2 ml無菌EP管中分別加入適量生理鹽水，然后按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，在EP管中分別加入5 μl miR-98模擬物或抑制物250μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻，室溫放置10 min；另外在5 μl脂質(zhì)體Lipofectamine 2000溶液中加入250 μl無血清Opti-MEM培養(yǎng)液，振蕩混勻后，室溫放置10 min；將上述兩種溶液吹打混勻，室溫放置30 min；將脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合液滴加至孔板細(xì)胞表面，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細(xì)胞RNA及蛋白，驗證目的基因表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。

1.11 RT-PCR方法檢測miR-98、LOX-1、NF-κB p65、ET-1基因的表達(dá)①提取總RNA：收集細(xì)胞1×1010個，置于EP管中；加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；加入200μl氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，取上清；加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12000 rpm離心，棄上清；將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。②RNA反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆?。③實時定量PCR：將20 μl反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴60 min，85℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進(jìn)行PCR。冰浴中配制20 μlPCR反應(yīng)體系，95℃30s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45次。引物序列如下：miR-98（上游引物：5’-TTTTGTTTTTGCTGGTCTTAG-3’；下游引物：5’-AGCAGACAGTCAGGCAGGAT-3’）；NF-κB p65（上游引物：5’-TGACTGGATTCG CTAGGTAGAAG-3’；下游引物：5’-GGCAA TTTTCAGAGCTATTAG-3’）；ET-1（上游引物：5’-GCTTAGGGGCTAATCGGACT -3’；下游引物：5’- CGAAACCTACTGATGGCCCTAG-3’）β-actin（上游引物：5’-CAGCTTT GAGGTTCGTGTTTGT-3’；下游引物：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA -3’）。

1.12 Western blot方法檢測miR-98、LOX-1、NF-κB p65、ET-1蛋白的表達(dá)①提取蛋白樣品；②蛋白樣品凝膠電泳；③轉(zhuǎn)膜；④封閉；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦顯影；⑧采用化學(xué)發(fā)光法檢測膜上的蛋白表達(dá)條帶，采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以積分光密度（IOD）表示灰度值。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理本資料采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理；計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK檢驗；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血漿中miR-98和LOX-1水平比較經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，AS組患者miR-98表達(dá)水平明顯低于健康受試者；經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示，AS組患者LOX-1表達(dá)水平明顯高于健康受試者。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（圖1～2）。

2.2 ox-LDL對HASMC細(xì)胞、HAEC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖活性的影響加入不同濃度ox-LDL分別干預(yù)48 h后，經(jīng)MTT檢測結(jié)果顯示，在ox-LDL 15μg/ml干預(yù)下，HAEC細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，與空白對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。ox-LDL干預(yù)對HASMC細(xì)胞幾乎無影響，HAMSC細(xì)胞一直正常生長（表1）。

圖1 健康受試者和AS患者血漿miR-98表達(dá)量比較（與健康受試者比較，aP＜0.05）

圖2 健康受試者和AS患者血漿LOX-1水平比較（與健康受試者比較，bP＜0.05）

2.3 HASMC細(xì)胞、HAEC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞miR-98表達(dá)情況經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在對照組中（0 μg/ml ox-LDL干預(yù)）HAEC和巨噬細(xì)胞中miR-98表達(dá)量明顯高于HASMC細(xì)胞，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；且經(jīng)15 μg/ml ox-LDL干預(yù)后，HAEC和巨噬細(xì)胞中miR-98表達(dá)量明顯降低，與干預(yù)前比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

2.4 miR-98模擬物和抑制物對LOX-1表達(dá)的影響經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-98可明顯抑制HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞LOX-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，與空白質(zhì)粒對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表2）。

2.5 miR-98模擬物和抑制物對NF-κB p65表達(dá)的影響經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-98模擬物轉(zhuǎn)染和抑制物轉(zhuǎn)染對NF-κB p65 mRNA的表達(dá)影響不明顯，與空白對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；但是經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-98模擬物轉(zhuǎn)染可明顯抑制HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞NF-κB p65蛋白的表達(dá)，而miR-98抑制物轉(zhuǎn)染可上調(diào)NF-κB p65蛋白的表達(dá)，與空白質(zhì)粒對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表3）。

2.6 miR-98模擬物和抑制物對ET-1表達(dá)的影響經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-98模擬物轉(zhuǎn)染可明顯抑制HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞ET-1mRNA和蛋白的表達(dá)，而miR-98抑制物轉(zhuǎn)染可上調(diào)ET-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，與空白質(zhì)粒對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（表4）。

圖3 HASMC細(xì)胞、HAEC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞miR-98表達(dá)量比較（與HASMC細(xì)胞組比較，aP＜0.05；與HAEC細(xì)胞組比較，bP＜0.05；與ox-LDL（0 μg/ ml）比較，cP＜0.05）

表3 miR-98模擬物和抑制物對HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的影響

表4 miR-98模擬物和抑制物對HAEC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞ET-1表達(dá)的影響

3 討論

我國是動脈粥樣硬化的高發(fā)地區(qū)，由AS引發(fā)的心腦血管疾病致死率是最重要的死亡原因之一。雖然AS的發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，但是“內(nèi)皮損傷-反應(yīng)”學(xué)說是目前公認(rèn)的AS形成機(jī)制[7]。關(guān)于AS的治療一直是全球醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難題。近年來MicroRNAs的研究為AS的治療提供了新的思路[8]。miRNAs作為內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過結(jié)合靶mRNA的3’端非編碼區(qū)，編碼區(qū)或5’非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，抑制或降解靶mRNA的翻譯，參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化等多種病理生理過程[9]。研究顯示，至少有一半以上的miRNA基因位于炎性反應(yīng)相關(guān)的基因組區(qū)域或者脆性位點，發(fā)揮促進(jìn)或抑制炎癥反應(yīng)的作用[10]，其中miR-98是早期發(fā)現(xiàn)的一類具有癌基因活性的小RNA，在很多惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[11]，但是目前關(guān)于miR-98與血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系研究尚少。本項研究在前期生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討miR-98對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制。

ox-LDL作為參與動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要損傷因素之一，通過與清道夫受體結(jié)合，刺激單核細(xì)胞遷移并轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，同時ox-LDL可促使泡沫細(xì)胞壞死形成AS條紋或斑塊，造成血管腔狹窄或阻塞[12]。因此干擾ox-LDL的表達(dá)是防治AS發(fā)生、發(fā)展的重要措施。LDX-1是位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑細(xì)細(xì)胞表面的主要清道夫受體之一，與LDL氧化密切相關(guān)[13,14]。有研究認(rèn)為[15]，LOX-1上調(diào)可能是AS發(fā)生的啟動因素，因此miR-98對LOX-1受體和ox-LDL的調(diào)控作用是筆者本項研究的重點，目前國內(nèi)關(guān)于這方面的研究還處于起步階段。筆者首先探討了AS患者血漿中miR-98和LOX-1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，AS組患者miR-98表達(dá)明顯下調(diào)，而LOX-1表達(dá)卻出現(xiàn)明顯上調(diào)。提示miR-98與LOX-1的表達(dá)可能呈負(fù)相關(guān)性，同時也肯定了miR-98可能參與了AS的發(fā)生、發(fā)展過程。LOX-1是ox-LDL特異性結(jié)合受體，筆者通過采用ox-LDL干預(yù)對HMASC、HAMSC、HAEC和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，ox-LDL在15 μg/ml時對miR-98的抑制作用最強(qiáng)。

在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步探討了miR-98對NF-κB信號通路的影響。ox-LDL通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧自由基的表達(dá)，從而激活NF-κB信號通路以及下游調(diào)控因子，如內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達(dá)[16]。本項研究中，我們通過構(gòu)建miR-98模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并檢測經(jīng)ox-LDL干預(yù)后細(xì)胞NF-κB p65和ET-1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示miR-98可明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，miR-98在動脈粥樣硬化早期可能通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用進(jìn)而抑制NF-κB炎性信號通路以及下游調(diào)控蛋白的激活，從而延緩AS的發(fā)展，為AS的治療提供了潛在靶點。