鹽酸替羅非班對心肌梗死大鼠心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β表達(dá)的影響

范群雄，趙繼先，李波，沈俊，張煥鑫

急性心肌梗死是由于冠狀動脈持續(xù)性缺血缺氧，導(dǎo)致心肌壞死的常見心血管疾病[1]。心肌梗死患者病灶區(qū)可出現(xiàn)膠原形成，在發(fā)病早期，膠原生成有利于心臟維持生理形態(tài)，改善心功能，然而，隨著膠原生成不斷增加，可造成左室重構(gòu)，增加患者心臟收縮與舒張阻力，并將影響心臟泵血功能[2]。

近年來，隨著對心肌梗死研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子如基質(zhì)金屬蛋白酶、金屬蛋白酶抑制因子等可通過調(diào)節(jié)膠原代謝影響心室重構(gòu)[3]。臨床改善心室重構(gòu)常用藥物如血管緊張素受體阻斷藥、醛固酮拮抗藥及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等，臨床治療效果并非十分理想，部分藥物對患者存在副作用。因此，研究能有效改善心肌梗死患者心室重構(gòu)的治療措施，對患者疾病控制具有重要促進(jìn)作用。鹽酸替羅非班是用于預(yù)防和治療由冠脈閉塞引起的心臟缺血的藥物。本研究選取清潔級Wistar大鼠作為研究對象，建立心肌梗死模型，探討鹽酸替羅非班對心肌梗死后大鼠心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）、金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-1）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）基因mRNA與蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與器械鹽酸替羅非班注射液，魯南貝特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20090328，規(guī)格50 ml：12.5 mg。戊巴比妥鈉、剪刀、止血夾、結(jié)扎線。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物選取24只清潔級雄性Wistar大鼠，6～7周齡，體重220～260 g，實(shí)驗(yàn)動物購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2013-1-003，使用許可證號SYXK（冀）2013-0026。大鼠飼養(yǎng)條件：自由進(jìn)食、飲水，室溫控制范圍23±2℃，濕度范圍45%～55%，人工控制日照燈模型晝夜交替規(guī)律。

1.3 模型建立建立心肌梗死模型，首先24只清潔級雄性Wistar大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（40～45 mg/kg）腹腔注射麻醉，充分麻醉后，固定好大鼠體位，以大鼠心尖搏動最強(qiáng)點(diǎn)為中心，橫向剪開大鼠皮膚，充分暴露大鼠心臟，分離冠狀動脈左前降支，于近端處使用結(jié)扎線進(jìn)行結(jié)扎，通過觀察心電圖變化，若大鼠心電圖呈現(xiàn)ST段弓背向上抬高，且左心室前臂顏色逐漸變暗，即可認(rèn)為手術(shù)成功。大鼠心肌梗死模型建立完成后，隨機(jī)分為對照組及觀察組，每組12只。

1.4 治療對照組：不給藥。觀察組：給予鹽酸替羅非班注射液治療，給藥量為5 mg/（kg·d），腹腔注射給藥，療程均為6周。

1.5 觀察指標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）、金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-1）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）基因mRNA表達(dá)檢測方法使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測[4]，蛋白表達(dá)量使用免疫蛋白印跡法檢測[4]。MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β采用免疫組化染色后，經(jīng)彩色圖像分析軟件進(jìn)行分析[4]，免疫組化法染色棕黃色為基因表達(dá)陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析使用SPSS 15.0處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β mRNA表達(dá)情況與對照組比較，觀察組大鼠MMP-2、MMP-9 及TGF-β mRNA表達(dá)均降低，而TIMP-1 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 兩組大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β蛋白表達(dá)的比較與對照組比較，觀察組MMP-2、MMP-9及TGF-β蛋白表達(dá)降低，TIMP-1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色與對照組比較，觀察組大鼠MMP-2、MMP-9及TGF-β表達(dá)均降低，TIMP-1表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 兩組大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β mRNA表達(dá)情況

圖2 兩組大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β蛋白表達(dá)的比較

3 討論

左室重構(gòu)是心肌梗死常見的病理改變[5]，主要是由膠原過度形成引起[6]，可造成心臟收縮和擴(kuò)張障礙，加速心肌梗死患者病情進(jìn)展，不利于疾病治療與恢復(fù)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解因子，而金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-1）是抑制MMPs的主要因子[7]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織中含有大量基質(zhì)金屬蛋白酶[8]，主要以MMP-2[9]和MMP-9[10]形式存在，能夠降解膠原、基底膜等細(xì)胞外基質(zhì)成分，引發(fā)心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)。

有研究發(fā)現(xiàn)，建立心肌梗死大鼠模型后，大鼠會出現(xiàn)左室重構(gòu)改變，且左室功能發(fā)生障礙，心肌間基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平顯著改變，且伴有細(xì)胞外基質(zhì)成分或結(jié)構(gòu)改變[11]?；|(zhì)金屬蛋白酶水平在發(fā)病早期呈代償性降低，隨著病情進(jìn)展，左室重構(gòu)改變后，基質(zhì)金屬蛋白酶活性上調(diào)，降解膠原、基底膜等成分。金屬蛋白酶抑制因子與基質(zhì)金屬蛋白酶處于動態(tài)平衡，當(dāng)基質(zhì)金屬蛋白酶過度活化或與金屬蛋白酶抑制因子間比例失調(diào)，可加重患者心室重構(gòu)及膠原纖維化程度。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）具有抑制心肌細(xì)胞分化作用[12]。心肌梗死患者TGF-β水平升高，表示存在心室重構(gòu)變化[13]。鹽酸替羅非班對冠脈閉塞引起的心臟缺血性疾病具有較好的預(yù)防和治療效果[14,15]。本次研究通過建立心肌梗死動物模型，主要目的是探討鹽酸替羅非班對大鼠心肌梗死后左室重構(gòu)的影響。

圖3 兩組大鼠心肌組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β免疫組織化學(xué)染色（×400）

急性心肌梗死后左心室重構(gòu)是影響急性心肌梗死患者進(jìn)展至心力衰竭[16]，甚至發(fā)生死亡的重要因素之一。如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌梗死后患者的心室重構(gòu)是心力衰竭患者防治的熱點(diǎn)問題[17]，但目前心室重構(gòu)發(fā)病機(jī)制仍未徹底闡明。本次研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠MMP-2、MMP-9及TGF-β mRNA表達(dá)均低于對照組，而TIMP-1 mRNA表達(dá)較對照組升高。與對照組比較，觀察組MMP-2、MMP-9及TGF-β蛋白表達(dá)降低，TIMP-1蛋白表達(dá)升高。免疫組化染色結(jié)果顯示，觀察組大鼠MMP-2、MMP-9、TGF-β低于對照組，且觀察組TIMP-1高于對照組。由此表明，鹽酸替羅非班能夠有效改善心肌梗死大鼠心肌中MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TGF-β基因mRNA及蛋白表達(dá)水平，并可以改善心肌梗死大鼠的左室重構(gòu)。