冠心病外周血中CX3CL1、CX3CR1的表達(dá)及臨床意義

廉錚，呂峰峰，王家旺

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦侵富颊吖跔顒用}血管出現(xiàn)粥樣硬化類型病變，并導(dǎo)致血管腔狹窄以及阻塞等癥狀的疾病。由于該病會引發(fā)心肌缺血以及缺氧甚至壞死等，對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重不良影響，同時動脈粥樣硬化程度加劇會增大發(fā)生急性心血管不良事件的風(fēng)險。近年來，我國冠心病臨床發(fā)病率不斷上升，受到社會高度關(guān)注，有關(guān)其發(fā)病機(jī)制的研究也成為當(dāng)前討論的重點(diǎn)[1,2]。研究顯示，導(dǎo)致冠心病患者動脈壁發(fā)生粥樣硬化病變的原因不僅局限于脂質(zhì)代謝紊亂，還與動脈壁炎癥密切相關(guān)[3]。而動脈粥樣硬化本身炎性過程十分復(fù)雜，與趨化因子以及其受體密切相關(guān)，其中趨化因子（CX3CL1）、受體（CX3CR1）能夠參與重要信號途徑，對粥樣硬化進(jìn)展產(chǎn)生影響[4,5]。因此，本文通過研究分析冠心病外周血中CX3CL1、CX3CR1的表達(dá)及臨床意義，旨在為臨床診治提供新型的監(jiān)測指標(biāo)，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象選擇2015年1月～2016年10月于滄州市中心醫(yī)院就診的冠心病患者195例納入本次研究，作為觀察組，其中男性114例，女性81例。年齡42～86歲，平均（59.83±9.24）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均冠心病有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②經(jīng)冠脈造影等影像學(xué)手段確診；③初次就診者；④年齡≥45歲；⑤研究對象已對本次研究知情同意，且經(jīng)過了院里的倫理委員會審批。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有繼發(fā)性的高血壓者；②有肥厚型或者擴(kuò)張型心肌病等其他種類的心肌病變者；③有卒中或惡性腫瘤型疾病者；④有血液疾病者；⑤有嚴(yán)重的肝腎功能不全或免疫性疾病者；⑥有甲狀腺疾病者。195例患者中，接受冠脈造影合并經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）治療者157例，單純接受冠脈造影但未PCI治療者38例。根據(jù)患者病情分為穩(wěn)定型心絞痛（SAP）53例，歸入SAP組，不穩(wěn)定型心絞痛（ UAP）56例，歸入UAP組，急性心肌梗死（AMI）86例，其中ST段抬高型AMI（STEMI）48例，非ST段抬高型AMI（NSTEMI）38例，歸入AMI組。另選同期在醫(yī)院接受健康體檢的志愿者60例納入對照組，其中男性36例，女性24例。年齡45～85歲，平均（59.82±9.31）歲。研究組與對照組年齡及性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，組間可比。

1.2 研究方法（1）酶聯(lián)免疫ELISA法檢測其外周血內(nèi)CX3CL1水平，取空腹靜脈血5 ml，于抗凝管內(nèi)添加1.5 mg/ml的乙二胺四乙酸二鈉實(shí)施抗凝，在室溫下?lián)u勻之后放入-20℃的冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆?。將收集到的血液?biāo)本給予20 min 3000 r/min的離心，而后分離血漿，再將血漿儲存在-80℃的低溫冰箱內(nèi)保存，待標(biāo)本完全收集好后統(tǒng)一檢測。檢測時先建立好CX3CL1標(biāo)準(zhǔn)曲線，測試好測定孔的OD值，分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品①1000 ng/ml；②500 ng/ml；③250 ng/ml；④125 ng/ml；⑤62.5 ng/ml；⑥32.25 ng/ml；⑦16.125 ng/ml；⑧0 ng/ml對應(yīng)的OD值于半對數(shù)紙上進(jìn)行作圖，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，OD值作為縱坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，再按照各測定樣品的OD值于曲線圖中查閱對應(yīng)的含量水平。再通過自身對照的方式檢測CX3CL1在PCI手術(shù)前后的表達(dá)差異。

（2）利用流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+CD28-CX3CR1+T細(xì)胞受體的表達(dá)水平。將手術(shù)前后采集到的所有受試者靜脈血，通過產(chǎn)自美國BD公司的經(jīng)FITC標(biāo)記后的抗CD4抗體和PE標(biāo)記后的抗CD28抗體，以及APC標(biāo)記后的CX3CR1抗體對血細(xì)胞實(shí)施標(biāo)記。再將100 μl經(jīng)肝素抗凝后的全血放在室溫下同以上3種抗體進(jìn)行30 min的孵育。通過專用洗液行10 min的避光孵育之后給予5 min的離心處理，再棄去上清，將血細(xì)胞通過1%的多聚甲醛固定，而后通過流式細(xì)胞儀測定CD4+CD28-CX3CR1+T細(xì)胞相關(guān)受體的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較行t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比觀察組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平分別為（2109.33±424.56）ng/ml、（15.38±2.68）%，均高于對照組的（1892.36±402.68）ng/ml、（4.84±1.60）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.2 各組患者CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比SAP組、UAP組及AMI組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平均較對照組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。UAP組及AMI組的CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平均較SAP組升高，且AMI組較UAP組也更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

表1 觀察組與對照組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比（±s）

表1 觀察組與對照組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比（±s）

組名 例數(shù) CX3CL1（ng/ml） CD4+CD28-CX3CR1+T（%）觀察組 195 2109.33±424.56 15.38±2.68對照組 60 1892.36±402.68 4.84±1.60 t值 - 3.503 28.896 P值 - 0.000 0.000

表2 各組患者CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比（±s）

表2 各組患者CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平對比（±s）

注：與SAP組比較，aP＜0.05；與UAP組比較，bP＜0.05

組名 例數(shù) CX3CL1（ng/ml） CD4+CD28-CX3CR1+T（%）SAP組 53 1859.65±113.48 11.96±2.65 UAP組 56 1926.87±185.55a 14.62±2.98a AMI組 86 2136.97±263.47ab 18.72±3.10ab F值 - 33.551 91.435 P值 - 0.000 0.000

2.3 不同治療方式及病情程度的患者外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T水平的對比冠脈造影合并PCI治療者術(shù)前和術(shù)后的外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T水平均分別較冠脈造影但未PCI治療者升高，且STEMI者較NSTEMI者也明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表3）。

2.4 患者外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T的相關(guān)性分析按照Spearman法對相關(guān)性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，患者外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T呈正相關(guān)（r=0.794，P=0.007）。

3 討論

冠心病主要病理改變?yōu)楣跔顒用}發(fā)生粥樣硬化，而引發(fā)粥樣硬化的主要原因在于患者冠狀動脈存在慢性炎癥[7]。有學(xué)者指出，冠心病患者血管壁發(fā)生的炎性反應(yīng)是由免疫細(xì)胞所介導(dǎo)，這一炎性反應(yīng)過程對冠心病發(fā)病起到關(guān)鍵作用[8,9]。據(jù)研究報道顯示，冠心病患者冠狀動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊主要以分泌趨化因子以及細(xì)胞因子等類型炎癥介質(zhì)的方式，來達(dá)到加強(qiáng)炎性反應(yīng)程度效果[10,11]。主要機(jī)制在于趨化因子等對斑塊纖維帽中膠原纖維成分進(jìn)行降解，使得斑塊纖維帽更加纖薄，同時伴隨其脂質(zhì)核心不斷增大，導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定結(jié)構(gòu)遭受改變而傾向破裂。斑塊不穩(wěn)定性被迫增大，如發(fā)生破裂其內(nèi)部炎性因子則會被釋放到血液中，因此，可通過檢測外周血內(nèi)炎性因子表達(dá)情況，來判斷冠心病患者冠狀動脈內(nèi)斑塊穩(wěn)定情況。CX3CL1為特殊結(jié)構(gòu)類型趨化因子，分膜結(jié)合特性以及可溶性兩種類型，分別起到促進(jìn)外周血內(nèi)白細(xì)胞游走以及黏附等作用。其中膜結(jié)合性質(zhì)CX3CL1有助于單核細(xì)胞以及T細(xì)胞等黏附，進(jìn)而使得滾動狀態(tài)白細(xì)胞固定并黏附于血管壁；而可溶性質(zhì)CX3CL1則可以對單核細(xì)胞和T細(xì)胞等產(chǎn)生強(qiáng)趨化作用[12,13]。CX3CR1則是CX3CL1的一種特異性受體，其主要來源為血管壁受損之后平滑肌細(xì)胞分化產(chǎn)生。由于冠心病外周血中CX3CL1、CX3CR1的表達(dá)異常，本研究以此為出發(fā)點(diǎn)深入探討，總結(jié)冠心病外周血中CX3CL1、CX3CR1的表達(dá)及臨床意義，為其他醫(yī)學(xué)工作者提供可靠建議。

本文通過研究發(fā)現(xiàn)，觀察組CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平均較對照組明顯更高，UAP組及AMI組的CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平均較SAP組明顯更高，且AMI組較UAP組也更高，上述結(jié)果提示冠心病患者CX3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T水平升高，且隨著患者癥狀的加重，水平上升更明顯。原因是因?yàn)镃X3CL1及CD4+CD28-CX3CR1+T參與了冠心病患者的病情進(jìn)展過程。CX3CR1可在單核細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等上表達(dá)，其作為CX3CL1的重要受體，二者相互作用，能夠?qū)λ饔眉?xì)胞本身功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如趨化、黏附以及分泌細(xì)胞因子等方面，進(jìn)而誘導(dǎo)斑塊生成并逐漸變得易損和破裂等，對加深動脈粥樣硬化病變程度起到促進(jìn)作用[14,15]。本研究結(jié)果顯示，患者外周血T細(xì)胞內(nèi)呈CX3CR1大量表達(dá)，則說明患者冠狀動脈斑塊內(nèi)出現(xiàn)炎性反應(yīng)，外周血內(nèi)T細(xì)胞中CX3CR1得到激活。同時，被激活的CX3CR1能夠進(jìn)一步將T細(xì)胞激活，進(jìn)而引發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)，加劇炎癥程度。本文還發(fā)現(xiàn)，冠脈造影合并PCI治療者術(shù)前和術(shù)后的外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T水平均分別較冠脈造影但未PCI治療者明顯更高，且STEMI者較NSTEMI者也明顯更高，進(jìn)一步按照Spearman法對相關(guān)性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，患者外周血CX3CL1和CD4+CD28-CX3CR1+T呈正相關(guān)。這提示了CX3CL1與CX3CR1的表達(dá)之間聯(lián)系十分緊密。經(jīng)研究證實(shí)，動脈粥樣型硬化屬于十分復(fù)雜炎性反應(yīng)過程，且需要由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及趨化因子等共同組成一個信號傳遞網(wǎng)絡(luò)來完成[16]。其中，CX3CL1與CX3CR1就參與并介導(dǎo)部分信號途徑，進(jìn)而對斑塊狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)及影響。當(dāng)冠狀動脈發(fā)生缺氧以及粥樣硬化和斑塊出現(xiàn)不穩(wěn)定狀況等情況時，單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等均會發(fā)生一定程度病理改變，且該過程均會有CX3CL1、CX3CR1參與[17,18]。其主要機(jī)制在于CX3CL1與CX3CR1形成生物軸，使得白細(xì)胞得到觸發(fā)，并黏附于活化狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞上，進(jìn)而激活血小板，經(jīng)CX3CL1誘導(dǎo)作用使血小板膜中P-選擇素加入白細(xì)胞募集活動[19]。此外趨化因子CX3CL1以及CX3CR1能夠?qū)魏思?xì)胞遷移活動進(jìn)行介導(dǎo)，并且其對單核細(xì)胞和血管上平滑肌細(xì)胞二者相互作用進(jìn)行誘導(dǎo)，同時當(dāng)CX3CL1以及CX3CR1經(jīng)過某些信號通路時，其活性會被激活，進(jìn)而加劇血管炎癥反應(yīng)程度[20]。

綜上所述，冠心病外周血中CX3CL1與CX3CR1的表達(dá)均明顯上調(diào)，且二者之間存在正相關(guān)，臨床上可對二者的表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測，從而更加有效地服務(wù)臨床診治過程。

表3 PCI治療前后患者外周血相關(guān)因子水平的對比（±s）

表3 PCI治療前后患者外周血相關(guān)因子水平的對比（±s）

注：與冠脈造影但未PCI治療者比較，aP＜0.05；與NSTEMI者比較，bP＜0.05

CX3CL1（ng/ml） CD4+CD28-CX3CR1+T（%）術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后冠脈造影合并PCI治療者（n=157） 2029.63±421.56a 2196.88±320.94a 13.24±1.63a 18.37±2.18a冠脈造影但未PCI治療者（n=38） 1884.32±115.66 1973.47±108.62 10.79±2.10 15.21±2.06 STEMI者（n=48） 2012.66±359.81b 2183.45±259.60b 13.19±2.55b 15.24±2.14b NSTEMI者（n=38） 1876.53±153.24 1948.37±149.56 10.32±1.02 12.63±2.04組名