玉米種質(zhì)對絲黑穗病的抗性分析及發(fā)病條件研究

郭 成， 趙瑞麗， 王春明， 張有富， 周天旺， 郭滿庫， 段燦星

(1. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 甘肅 蘭州730070； 2. 農(nóng)業(yè)部天水作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站， 甘肅 天水741200；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 甘肅 蘭州730070； 4. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院， 甘肅 張掖734000；5. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程， 北京100081)

玉米(Zeamays)是禾本科(Poaceae)一年生糧食、飼料、油料和工業(yè)原料作物，在國民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位[1-3]。2017年中國玉米種植面積和總產(chǎn)量均居農(nóng)作物之首，分別為3 544.5萬hm2和21 589.1萬t，較2016年減產(chǎn)1.7%[4]。因此，玉米的生產(chǎn)穩(wěn)定性直接影響到我國糧食作物的生產(chǎn)安全和延伸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。病蟲害是制約玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素，我國每年因病蟲害發(fā)生和流行而導(dǎo)致玉米產(chǎn)量損失約1 000萬t[6]。

玉米絲黑穗病是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害，由孢堆黑粉菌(Sporisoriumreilianum)引起，是一種對玉米生產(chǎn)造成極大危害的土傳真菌病害[7]。近年來，隨著感病品種或制種親本的連年種植、秸稈還田后造成病菌大量累積，如沈試系列、沈單系列、掖單51、掖單13、登海1號、白單31等品種和以黃早四及其改良系為代表的親本自交系，致使玉米絲黑穗病又開始回升蔓延并呈加重趨勢[8]。2017年本課題在甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)站調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分雜交種發(fā)病率高達(dá)65.2%，但不同玉米品種對絲黑穗病的抗性不同，品種間差異明顯。

玉米作為青貯飼料，對草食畜牧業(yè)的發(fā)展，起著舉足輕重的作用[9]。青貯玉米感染絲黑穗病后不僅會影響產(chǎn)量，還會影響飼料質(zhì)量，牲畜食用后會導(dǎo)致健康問題[10]。選育和種植抗病品種是防止玉米絲黑穗病發(fā)生流行和穩(wěn)產(chǎn)增收的重要措施，鑒定和評價玉米品種及育種親本的抗病性則是抗病育種的重要環(huán)節(jié)[11]。許多學(xué)者經(jīng)過大量研究，篩選出了一批高抗自交系[12-18]，如KH13、FR218、D2374、T432、育系243、育系254、育系490、育系541、吉T5、吉63/o2、吉846、吉992、赤L5、赤L155、粵48、粵57-1、酒341-2、魯原92、鄭653、沙1、寧45、晉穗54等。但具備突出抗絲黑穗病特性的優(yōu)異種質(zhì)資源仍然缺乏，因此，廣泛發(fā)掘在未來育種中可以利用的絲黑穗病抗源仍是玉米資源鑒定的重要工作之一。

玉米絲黑穗病發(fā)病率等于損失率的產(chǎn)量損失特點(diǎn)，對玉米產(chǎn)業(yè)的為害尤為嚴(yán)重，因此，控制該病害的發(fā)生和為害具有極其重要的意義?？共∑贩N的有效利用不僅降低了病害發(fā)生率和產(chǎn)量損失，也是國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“雙減項(xiàng)目”中減藥的重要舉措之一。因此，種植和利用抗病品種是控制病害最安全和高效的措施，而優(yōu)異的抗性種質(zhì)是進(jìn)行抗病品種選育和種質(zhì)改良的前提和基礎(chǔ)。因此，本研究在2012—2015年間對國家玉米種質(zhì)資源庫中1164份玉米種質(zhì)進(jìn)行了絲黑穗病抗性鑒定和評價，擬為玉米抗絲黑穗病育種提供核心抗源和技術(shù)支持。同時通過田間不同播期和接菌量試驗(yàn)，對絲黑穗病的發(fā)病溫度和菌源量進(jìn)行了分析，以期明確絲黑穗病發(fā)病的最佳發(fā)病溫度，為絲黑穗病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料：初次鑒定材料2012年270份，2013年300份，2014年290份，2015年304份，共1164份玉米種質(zhì)資源，包括 900份玉米自交系、261份農(nóng)家種和3份群體材料，其中國外引進(jìn)種質(zhì)205份，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

表1 供試玉米材料來源與數(shù)量Table 1 Origin and number of maize germplasm

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種質(zhì)資源抗性鑒定 絲黑穗病原冬孢子：將上年從典型病株上采集的病癭，裝布袋于通風(fēng)處越冬，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所采集并保存。播種前1周將病癭上的菌粉抖落，用40目細(xì)篩篩出冬孢子，按0.1%比例與細(xì)土充分混合配成菌土備用。

鑒定圃設(shè)在甘肅省天水市甘谷縣新興鎮(zhèn)五甲村，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所甘谷試驗(yàn)站，年平均氣溫為9.5～10.9℃，降雨量為480 mm左右，無霜期約180 d。由于種質(zhì)資源抗性鑒定具有材料多、種子量較少的特點(diǎn)，因此抗性鑒定均采用無重復(fù)鑒定方式，于2012—2015每年4月中旬進(jìn)行田間春播，每份材料均按單行人工穴播種植，行長約10 m，行、穴距為40 cm×40 cm。每穴點(diǎn)播種子4粒，覆蓋菌土100 g。待4～5葉1心期，每穴隨機(jī)留苗2株。根據(jù)每年材料數(shù)量在鑒定圃內(nèi)設(shè)Mo17(R)和黃早四(HS)對照5組及以上。

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部頒布的玉米抗絲黑穗病鑒定技術(shù)規(guī)范進(jìn)行[19]。病情分級和抗性分級標(biāo)準(zhǔn)為：1級：病株率0～1.0%，高抗(HR)；3級：病株率1.1～5.0%，抗(R)；5級：發(fā)病株率5.1～10.0%，中抗(MR)；7級：發(fā)病株率10.1～40.0%，感(S)；9級：發(fā)病株率40.1～100%，高感(HS)。在玉米進(jìn)入乳熟期后，對供試材料逐株進(jìn)行調(diào)查，記載總株數(shù)，發(fā)病株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率。根據(jù)病株率，評價供試材料的抗感水平。供試材料在初次鑒定中表現(xiàn)為抗性及高抗時，次年進(jìn)行重復(fù)鑒定。

1.2.2土壤溫度和接菌量試驗(yàn) 土壤溫度對玉米絲黑穗病發(fā)病影響：播期試驗(yàn)安排在同一試驗(yàn)地塊中，試驗(yàn)地前5茬均種植小麥，于2016年4月17日開始播種，每3天播種1次，即2016年4月17日、4月20日、4月23日、4月26日、4月29日、5月2日和5月5日分別播種玉米自交系黃早四，行長約5 m，行、穴距為60 cm×20 cm，每穴點(diǎn)播種子2粒，覆蓋菌土100 g，每次設(shè)4次重復(fù)。土壤溫度采用人工智能氣象站，購自Campbell Scientific，Inc，數(shù)據(jù)采集器型號：CR6，采集0～10 cm的日平均地溫，土壤溫度為播種到出苗時的0～10 cm的平均地溫。

接菌量對玉米絲黑穗病發(fā)病影響：于2016年4月20日播種玉米品種沈單16，分別按0.1%,0.2%和0.3%的比例，將菌粉與細(xì)土充分混合配成菌土覆蓋玉米種子，行長約5 m，行、穴距為60 cm×20 cm，每穴點(diǎn)播種子2粒，每個處理設(shè)4次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理來源與不同類型玉米種質(zhì)對絲黑穗病的抗性水平

針對不同地理來源的種質(zhì)資源，比較了6個不同省份種質(zhì)(份數(shù)較多)的抗性情況，在內(nèi)蒙古、山西、云南、黑龍江、河北和廣東種質(zhì)中，抗絲黑穗病(HR+R)種質(zhì)占比分別為11.34%、5.13%、0.83%、14.86%、9.38%和0.00%，表明我國不同地區(qū)玉米種質(zhì)的抗絲黑穗病強(qiáng)弱以及抗性多樣性存在較大的差異，來自于云南和廣東的種質(zhì)，其整體抗性水平明顯低于內(nèi)蒙古和黑龍江。在7個篩選出高抗自交系的地區(qū)中，內(nèi)蒙、美國、黑龍江、山西、云南、河北和陜西占供試自交系比例分別為1.56%，1.44%，0.44%，0.33%，0.11%，0.11%和0.11%。

如圖1所示，在鑒定的1164份玉米種質(zhì)中，38 份材料表現(xiàn)高抗，61 份材料表現(xiàn)抗，140份表現(xiàn)中抗，566 份表現(xiàn)感，359份表現(xiàn)高感，分別占總材料的3.26%，5.24%，12.03%，48.63%和30.84%。由圖2可知，表現(xiàn)中抗以上的自交系共226份，占供試自交系的25.11%，而表現(xiàn)中抗以上的農(nóng)家種僅12份，占供試農(nóng)家種的4.60%，因此，在玉米絲黑穗病的抗性水平上，農(nóng)家種的抗性低于自交系。

2.2 自交系對絲黑穗病的抗性水平

在900份國內(nèi)外自交系中，37份自交系如丹599,L91073,866,173,KH13,03GEM00041,03GEM00065(1),03GEM00110,03GEM00126(2),03GEM00142(2),03GEM00148,04GEM00277(1),04GEM00768(2),04GEM00770(1),07GEM02289,07GEM02902,07GEM02919(2),07GEM02935,yc00(30-1),H11,05-881,BR27,YH09-272,B07144,cf-1,B07137,H1535,7022,cf-4,664062,B07013,沈11-16,88017,7408,7435,7505,7541表現(xiàn)高抗(HR)；58份自交系如W6,478,4619,沈137,A580,KL53,KL4,鄭22,鄭653,鄭58,隴0205,W6765/Su,2010X450,09H144,65長35,D-091,gs18,赤H16,赤H9,法7-1,鄂系3,赤019,巴系504,M12,赤74592等表現(xiàn)抗(R)；131份自交系如5320,W22,W216,W286,選502,T405,T409,哲5762,D2374,赤L111,赤L160,遼自四,KL57,A461,A451,KL2B,KH13等表現(xiàn)中抗(MR)；庫6-49,472-3,T432,W15,W78,W103,W218,W236,W253,W256,W257,W277,W298等398份表現(xiàn)感病(S)；而P78選3-1,白53,廊H,DJ28,W17,W77,W238,W239,W456,W473,W582,早215等279份表現(xiàn)高感(HS)，分別占供鑒自交系的4.1%，6.4%，14.6%，43.9%和31.0%(圖2)。表現(xiàn)高抗和抗的自交系見表3。

圖1 玉米種質(zhì)所占抗性比例Fig.1 The proportion of resistance types of maize germplasms

圖2 自交系和農(nóng)家種分別所占抗性比例Fig.2 The proportion of differen resistance types of inbred lines and landraces respectively

2.3 農(nóng)家種對絲黑穗病的抗性水平

在供鑒的261份國內(nèi)外農(nóng)家種中，1份材料SW91D-323-7 Ki1414表現(xiàn)高抗(HR)；3份02GEM80058、04GEM80040和04GEM00765表現(xiàn)抗(R)；8份86122-1-1、B681、老烏糯(232338)、糯包谷(232265)、04GEM80014、03GEM80037、07GEM 80044、M98表現(xiàn)中抗(MR)；Pob43C3、Pob49C2、Pob28C2、Pob502、冀群4、Z83149-1-2、中雜選1、B690、B711、B721、粵C10、粵C10-1、粵C0-M2、粵C1-P、粵C1-M、粵C1-PM等170份表現(xiàn)感病(S)；Pob32 C2、Stay GreenC4、P039-5-1、86039-5-1、Z83149-2-1,86102-1-1,86田野-2、86102-2-1-1-2、6161-17、吉單71986、B67-512等79份表現(xiàn)高感(HS)，分別占供鑒農(nóng)家種的0.4%，1.1%，3.1%，65.1%和30.3%，見圖2。表現(xiàn)高抗和抗的農(nóng)家種見表4。

續(xù)表4

續(xù)表4

2.4 群體材料對絲黑穗病的抗性水平

在來自中國上海的3份群體材料中，未發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)高抗和抗的材料，中抗、感和高感各1份，分別為91at692、91at690和91at691。

2.5 不同農(nóng)家種抗玉米絲黑穗病聚類分析

不同來源農(nóng)家種材料41份，根據(jù)其對玉米絲黑穗抗性反應(yīng)表型相似程度的差異，以最長距離法λ=18.57，可以將41農(nóng)家種材料用聚類分析法繪成譜系圖(圖3)。其中第1類為高抗性材料，為SW91D-323-7 Ki1414，發(fā)病率為0；第2類為抗性材料，由04GEM00765、04GEM80040和02GEM80058共3份材料組成，發(fā)病率在2.2%～3.85%；第3類是中等抗性材料，包括白洋包谷、B681、糯包谷、老烏糯等共9份材料，發(fā)病率在6.25%～12.82%；第4類為感病材料，分別為D48C2、MIRSyn C3、粵C0-1、白馬牙等13份材料，發(fā)病率在19.1%～39.13%；第5類為高感病材料，由紫包谷、PEM、D9C2、小黃玉米等共15份材料組成。

2.6 土壤溫度和接菌量對發(fā)病的影響

調(diào)查結(jié)果顯示，0～10cm地溫在14.3～18.7℃，發(fā)病率在60.47%～90.21%。溫度為18.7℃，發(fā)病率最低，病株率為60.47%，與其它6個溫度差異較顯著(P<0.05)；溫度為15.8℃，黃早四的病株率高達(dá)90.21%，與地溫16.3℃和17.9℃2個處理間差異不顯著(P>0.05)，但與其它處理間差異顯著(P<0.05)。分析發(fā)現(xiàn)，溫度在15.8～17.9℃，病株率在85%以上(表5)。研究發(fā)現(xiàn)，接菌量為0.1%,0.2%和0.3%時，病株率分別為33.55%,45.02%和48.48%，即病株率與接菌量成正相關(guān)(圖4)。

圖3 農(nóng)家種玉米品種對絲黑穗病抗性最長距離法聚類分析譜系圖Fig.3 The clustering analysis drawing on the disease resistance of maize peasant resources by Longest Distance Method(LDM)

表5 溫度對發(fā)病率的影響Table 5 The effects of temperature on disease incidence

圖4 接菌量對發(fā)病率的影響Fig.4 The effects of inoculum amount on disease incidence

3 討論

目前抗絲黑穗病鑒定方法有幼苗的褪綠斑點(diǎn)鑒定、質(zhì)壁分離法鑒定、乳酚油棉蘭染色玉米生長錐鑒定等方法[20-22]，此類方法測定的結(jié)果都停留在相關(guān)性描述上，沒有給出相關(guān)的性狀測定方法和抗性評價標(biāo)準(zhǔn)，一直無法用于抗性資源鑒定[23]。上述每種方法都有一定的局限性，如在苗期利用侵染葉片上褪綠斑點(diǎn)的形成來鑒定抗病性的方法僅適用于自交系[24-25]。苗期癥狀也并不十分穩(wěn)定，常因品種抗病性、菌源量及土壤環(huán)境而變化，苗期癥狀易與其它病毒病、生理病害及機(jī)械傷害等所致癥狀相混淆，所以只能作為早期診斷的參考。目前通用也是最穩(wěn)定的鑒定方法是接種后乳熟期進(jìn)行發(fā)病率鑒定[25-27]，因此，本研究利用人工接種進(jìn)行了抗絲黑穗病篩選，通過初次鑒定和重復(fù)鑒定，篩選出具有抗性種質(zhì)238份，占供試材料的20.45%，可為育種部門提供核心抗源。然而高抗種質(zhì)僅38份，占3.26%，表明高抗種質(zhì)極其匱乏，這與郭成等[18]研究結(jié)果一致。

華致甫等[28]用婦人指等5個自交系作為鑒別寄主，對來自新疆等9個省區(qū)的絲黑穗菌標(biāo)樣的致病力及其酸性磷酸酯酶和酯酶同工酶試驗(yàn)，認(rèn)為在我國玉米絲黑穗病菌中至少存在5個生理小種，甘肅、四川、吉林、陜西、云南是1號，為優(yōu)勢小種。由此可見，甘肅玉米絲黑穗病菌致病力強(qiáng)，極具代表性，所以該批次材料對絲黑穗病的抗性評價分析比較客觀和準(zhǔn)確。

本研究中篩選出自交系和農(nóng)家種中表現(xiàn)中抗以上的種質(zhì)分別占總鑒定種質(zhì)的25.11%和4.60%，表明玉米自交系中的抗性資源較農(nóng)家種豐富，這與段燦星等[5]對腐霉莖腐病和鐮孢穗腐病研究結(jié)果一致。研究結(jié)果同時表明不同地區(qū)玉米種質(zhì)對絲黑穗病抗性強(qiáng)弱以及抗性多樣性存在較大的差異，來自云南和廣東的種質(zhì)對絲黑穗病的抗性水平明顯低于內(nèi)蒙古和黑龍江。

聚類分析的功能是建立一種分類方法，它將一批樣品或變量按照它們在性質(zhì)上親疏程度進(jìn)行分類[29]。本文采用聚類分析方法對玉米材料抗性進(jìn)行研究，在對41個農(nóng)家種玉米種質(zhì)進(jìn)行抗絲黑穗的系統(tǒng)分析中，利用DPS軟件用最長距離法進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，41份材料可劃分為5類。在譜系圖上，抗病性相同的品種大致劃分在同一個類中，但通過比較它們的譜系圖和農(nóng)業(yè)部頒布的玉米抗絲黑穗病鑒定技術(shù)規(guī)范劃分的抗病類型，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在一定的偏差，如農(nóng)家種白洋包谷發(fā)病率為12.82%，根據(jù)玉米絲黑穗病鑒定技術(shù)規(guī)范應(yīng)劃分為感病，但在聚類分析圖中卻將其與B681、糯包谷、老烏糯等8個中抗材料歸為一類，由此可見，聚類分析在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性，但可以作為抗性評價的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究鑒定出38 份高抗種質(zhì)，61 份抗病種質(zhì)，140份中抗種質(zhì)，566 份感病種質(zhì)和359份高感種質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)玉米自交系中的抗絲黑穗病資源較農(nóng)家種豐富，不同地區(qū)玉米種質(zhì)抗性強(qiáng)弱以及抗性多樣性存在較大的差異，來自云南和廣東的種質(zhì)其抗性水平明顯低于內(nèi)蒙古和黑龍江。研究結(jié)果同時表明0～10 cm的土壤溫度在15.8～17.9℃，為玉米絲黑穗病發(fā)病的溫度，其中15.8℃為最佳發(fā)病溫度；隨著接菌量的增加，病株率也隨之增加，發(fā)病愈加嚴(yán)重。