超聲輔助脫脂對(duì)牦牛骨粉制備及其理化特性的影響

秦曉潔，沈青山，賈 偉，張春暉,，鄭乾坤

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超聲輔助脫脂對(duì)牦牛骨粉制備及其理化特性的影響

秦曉潔1，沈青山1，賈 偉1，張春暉1,2※，鄭乾坤2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2. 得利斯集團(tuán)有限公司，濰坊 262216）

為提高牦牛骨粉的脫脂率，以青海牦牛股骨為原料進(jìn)行超聲輔助有機(jī)溶劑脫脂參數(shù)優(yōu)化，并比較分析了超聲脫脂法和蒸煮脫脂法對(duì)骨粉制備的影響。該文以脫脂率為指標(biāo)篩選高效脫脂溶劑；通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)超聲脫脂參數(shù)（超聲功率、脫脂時(shí)間及液料比）進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)比分析了2種脫脂牦牛骨的脫脂率、蛋白質(zhì)流失率、主要礦物質(zhì)流失率、微觀形態(tài)及其骨粉的粒徑分布、微觀形態(tài)、化學(xué)結(jié)構(gòu)和鈣離子釋放度。結(jié)果顯示：乙酸乙酯為最佳脫脂溶劑；超聲功率500 W，超聲時(shí)間30 min，液料比（體積質(zhì)量比）6為最佳脫脂參數(shù)，此條件下脫脂率達(dá)92.00%，顯著高于蒸煮脫脂法（71.25%）（<0.01）；與蒸煮脫脂法相比，超聲脫脂法蛋白質(zhì)流失率（8.11%），主要礦物質(zhì)元素Na、K、Fe、Mn流失率顯著降低（<0.05），微觀結(jié)構(gòu)更加致密；超聲脫脂法和蒸煮脫脂法制得牦牛骨粉中值粒徑（D50）分別為35.84和11.73；紅外光譜顯示兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化；鈣離子釋放度結(jié)果顯示兩者同樣無(wú)顯著差異（>0.05）。超聲波輔助有機(jī)溶劑脫脂處理制備骨粉可更多保留骨中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)改善骨粉加工工藝及提高骨粉品質(zhì)具有一定的參考價(jià)值。

超聲；脫脂；溶劑；牦牛；骨粉；蒸煮

0 引 言

牦牛是生活在中國(guó)青藏高原的特色物種之一，牦牛骨骼（yak bone，YB）占軀體總生物量1/3，富含膠原蛋白、軟骨素、維生素以及鈣、磷、鎂、鋅等骨生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)素[1-2]，其中膠原蛋白占總蛋白質(zhì)量的35%～40%[3]。研究表明，動(dòng)物骨中的蛋白質(zhì)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]，其中的骨膠原蛋白肽能改善人體皮膚膚質(zhì)[5]，促進(jìn)大鼠股骨的骨折愈合和人成骨細(xì)胞I型膠原蛋白基因的表達(dá)[6]。此外，骨骼中的Ca∶P比值近似為2，是人體吸收鈣磷的最佳比例[7]，但多以磷酸鈣形式存在于羥基磷灰石晶體中，溶解度很低并且羥基磷灰石與膠原蛋白有機(jī)結(jié)合，難以得到有效利用[8-9]。

對(duì)原料骨進(jìn)行脫脂處理是骨粉制備的前提。目前，以牦牛骨為原料開(kāi)發(fā)了骨粉、明膠等一些基礎(chǔ)生化原料和牦牛骨髓壯骨粉等保健品[10-11]。趙要武等[12]研究發(fā)現(xiàn)牦牛骨粉（yak bone powder，YBP）可增加骨密度，并具有較高的鈣表觀吸收率。但牦牛骨中含有大量油脂，其產(chǎn)品極易氧化酸敗，產(chǎn)生不良風(fēng)味和有害物質(zhì)[13]，影響產(chǎn)品感官品質(zhì)，危害身體健康[14-15]。同時(shí)，脂肪的存在不利于畜骨進(jìn)一步粉碎，阻礙蛋白質(zhì)溶出和礦物質(zhì)元素吸收，對(duì)骨粉品質(zhì)有很大影響[16-17]。脫脂處理可以明顯改善肉骨粉的風(fēng)味和色澤，顯著提高肉骨粉的品質(zhì)[18]。傳統(tǒng)的動(dòng)物脫脂法有機(jī)溶劑法、酶法、酸堿法、蒸煮法和超聲波乳化法等[19]，普通有機(jī)溶劑法脫脂率較高，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑殘留等問(wèn)題；酶法不易分離，后續(xù)加工困難且成本高；酸堿法脫脂率較高，但容易對(duì)原料中的蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成損傷，污染環(huán)境不利于實(shí)際生產(chǎn)；蒸煮法在生產(chǎn)實(shí)踐中以高溫高壓蒸煮為主，但脫脂率低，生產(chǎn)成本較高，易造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失。

超聲輔助脫脂技術(shù)是利用超聲波產(chǎn)生的空化作用及伴隨產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等次級(jí)效應(yīng)，能夠有效加速油脂的擴(kuò)散和溶出[20-21]。超聲波輔助乳化劑可使豬皮的脫脂率達(dá)到68.67%[22]；超聲輔助常溫脫脂可使蠶蛹的脫脂率達(dá)到96.8%[23]。然而使用超聲波輔助有機(jī)溶劑對(duì)骨原料脫脂制備骨粉的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)超聲波輔助有機(jī)溶劑脫脂方法進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高脫脂率的同時(shí)保留更多營(yíng)養(yǎng)成分以提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性，為改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料骨：隨機(jī)選取來(lái)自青藏地區(qū)的2～3歲牦牛6頭，屠宰后取其股骨（不含軟骨）剔除碎肉、筋等雜質(zhì)，粉碎得到5～10 mm的骨顆粒于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：無(wú)水乙醇，異丙醇，正己烷，乙酸乙酯，氫氧化鈉，濃硫酸，高氯酸，異丙醇，硝酸，無(wú)水乙酸鈉，一水檸檬酸，正丙醇，氯胺，對(duì)二甲氨基苯甲醛，氧化鑭，碳酸鈣，鹽酸，胃蛋白酶（1 200 U/g）。以上試劑皆為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW 100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；歐諾全溫度恒溫培養(yǎng)搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）； SER148脂肪測(cè)定儀（意大利VELP公司）；KJELTEC2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀（丹麥FOSS公司）；行星式球磨儀PM200（上海弗尓德儀器設(shè)備有限公司）；CAMSIZER X2（上海弗尓德儀器設(shè)備有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；雙光束原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）；傅里葉近紅外光譜分析儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR，瑞士Bruker公司）；場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨基本成分測(cè)定

脂肪含量測(cè)定：索氏抽提法，依照GB5009.6-2016進(jìn)行。水分含量：直接干燥法，依照GB5009.3-2016進(jìn)行?；曳趾浚厚R弗爐高溫灼燒法，依照GB5009.4-2016進(jìn)行。蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法，依照GB5009.5-2016進(jìn)行。羥脯氨酸含量：依照GBT9695.23-2008進(jìn)行測(cè)定。Ca含量測(cè)定：火焰原子吸收光譜法，依照GB5009.92- 2016進(jìn)行。礦物質(zhì)含量測(cè)定：電感耦合等離子體質(zhì)譜法，依照GB5009.268-2016進(jìn)行。

1.3.2 牦牛骨脫脂參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)

1）脫脂工藝

蒸煮脫脂法[24]：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等雜質(zhì)→初步粉碎（5～10 mm）→稱(chēng)樣并預(yù)煮2 min去腥→瀝干→高溫高壓蒸煮處理（118℃，90 min，骨：水比為1：2.5）→撇除上層油脂并瀝干→75 ℃條件下通風(fēng)干燥12 h。

超聲脫脂法：牦牛腿骨（30 g）→剔除筋膜、肉等雜質(zhì)→初步粉碎（5～10 mm）→稱(chēng)樣→與脫脂溶劑以一定的液料比混合→超聲脫脂處理→溶劑回收→38℃條件下通風(fēng)干燥12 h→測(cè)定殘留脂肪含量。

2）脫脂溶劑的篩選

基于不同脫脂溶劑在其他脫脂研究中的應(yīng)用條件，本試驗(yàn)中分別選取無(wú)水乙醇、異丙醇、正己烷、乙酸乙酯作為脫脂溶劑，在超聲功率300 W、液料比（體積質(zhì)量比，下同）為2、時(shí)間為20 min的條件下（常溫）對(duì)牦牛骨進(jìn)行超聲脫脂，測(cè)定脫脂前后牦牛骨中的脂肪含量，比較4種不同溶劑的脫脂效果，計(jì)算脫脂率。

3）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在30 ℃的恒定水溫條件下對(duì)牦牛腿骨進(jìn)行超聲脫脂單因素實(shí)驗(yàn)，各因素的基本條件為：超聲功率300 W、脫脂時(shí)間20 min、液料比為2。各因素梯度分別設(shè)置為：超聲功率：200、300、400、500、600 W；脫脂時(shí)間：20、30、40、50、60 min；液料比：2、3、4、5、6。每次改變其中一個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以牦牛骨的脫脂率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)因素重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定結(jié)果取平 均值。

4）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，考察超聲功率、脫脂時(shí)間、液料比3個(gè)因素及其交互作用對(duì)脫脂率的影響，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平表

1.3.3 脫脂率、膠原蛋白含量及流失率計(jì)算

脫脂率的計(jì)算：取5 g脫脂牦牛骨，依照GB 5009.6- 2016對(duì)其脂肪含量進(jìn)行測(cè)定，做3次平行，取平均值，脫脂率的計(jì)算按照公式（1）。

式中為脫脂率，%；1為原料牦牛骨中脂肪的質(zhì)量，g；0為脫脂牦牛骨中脂肪的質(zhì)量，g。

膠原蛋白含量的計(jì)算：取100 mg脫脂牦牛骨，依照GB/T9695.23-2008對(duì)其羥脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，做3次平行，取平均值，膠原蛋白含量及流失率的計(jì)算分別按照公式（2）、（3）。

式中羥脯氨酸為羥脯氨酸質(zhì)量，mg；為膠原蛋白質(zhì)量，mg；為膠原蛋白流失率，%；0膠原蛋白為原料牦牛骨中膠原蛋白質(zhì)量，mg；1膠原蛋白為脫脂牦牛骨中的膠原蛋白質(zhì)量，mg，6.77為羥脯氨酸與膠原蛋白之間的換算系數(shù)[25]。

1.3.4 牦牛骨粉制備

備用脫脂牦牛骨用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎45 s（15 s/次，共3次），篩分獲得60～100目牦牛粗骨粉，用行星式球磨儀制備牦牛骨粉備用[26]。參數(shù)設(shè)置：350 r/min，4 h，磨球直徑為10 mm。

1）牦牛骨及骨粉主要礦物質(zhì)流失率計(jì)算

牦牛骨及骨粉主要礦物質(zhì)含量依照GB 5009.268-2016進(jìn)行測(cè)定，做3次平行，取平均值，流失率率的計(jì)算按照公式（4）。

式中0礦物質(zhì)元素為原料牦牛骨中礦物質(zhì)元素質(zhì)量，mg，1礦物質(zhì)元素為脫脂牦牛骨中礦物質(zhì)質(zhì)量，mg，為礦物質(zhì)元素流失率，%。

2）牦牛骨粉粒度分布及其微觀形態(tài)觀察

粒度分布：牦牛骨粉的粒度分布采用CAMSIZER X2測(cè)定，骨粉的平均粒徑采用中值粒徑50表示。

微觀形態(tài)：牦牛骨及骨粉的微觀形態(tài)參考Yin等[27]，采用掃描電鏡觀察，加速電壓為10 kV。

3）牦牛骨粉化學(xué)結(jié)構(gòu)分析及鈣離子釋放度測(cè)定

化學(xué)結(jié)構(gòu)分析：化學(xué)鍵分析參考Boutinguiza等[28]的方法，用FT-IR紅外光譜分析儀分析，波數(shù)掃描范圍為600～4 000 cm–1。

鈣離子釋放度檢測(cè)：稱(chēng)取0.25 g牦牛骨粉于50 mL離心管（精確至0.001 g），加入25 mL消化液（用HCl調(diào)至pH值為2），添加胃蛋白酶（60 U/mL），混勻，封口。將上述離心管放置37 ℃恒溫?fù)u床提取3 h，100 r/min。提取結(jié)束后，在4 000 r/min條件下離心30 min。取上清過(guò)濾并定容至100 mL容量瓶，稀釋100倍后用火焰原子吸收光譜儀進(jìn)行檢測(cè)[29]。做3次平行試驗(yàn)。其計(jì)算公式如（4）。

式中為牦牛骨粉鈣離子釋放度，%；上清鈣為上清液中鈣的質(zhì)量，mg；樣品鈣為樣品中鈣的總質(zhì)量，mg。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用SPSS22.0軟件one-way ANOVA 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析同時(shí)利用 Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢測(cè)，其中各圖同一指標(biāo)中不同字母表示差異顯著（<0.05或<0.01）運(yùn)用Origin8.0作圖；利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)面的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛骨基本成分含量表

牦牛骨基本成分含量如表2所示。脂肪含量高達(dá)25.15%，不利于骨的進(jìn)一步粉碎，其產(chǎn)品極易氧化酸敗，嚴(yán)重影響骨粉品質(zhì)[16-17]。蛋白含量為24.90%，高于魯西牛、延邊牛、南陽(yáng)牛、秦川牛的同部位蛋白含量[30]。這表明，牦牛骨雖然富含營(yíng)養(yǎng)成分但脂肪含量較高，因此有必要對(duì)牦牛骨進(jìn)行脫脂處理。

表2 牦牛骨主要成分含量

2.2 超聲波輔助有機(jī)溶劑脫脂參數(shù)優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1a可以看出，正己烷和乙酸乙酯脫脂效果顯著優(yōu)于無(wú)水乙醇和異丙醇，二者之間無(wú)顯著差異（>0.05）。此外，乙酸乙酯具有良好的溶解性、揮發(fā)性，其沸點(diǎn)低、毒性小，是一種易于回收并被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定允許使用的食品添加劑。因此最終選取乙酸乙酯作為最適脫脂溶劑。

由圖1b可以看出，牦牛骨脫脂率隨超聲功率的增大呈遞增趨勢(shì)，可能由于功率增大，空化效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)增強(qiáng)，其具有的能量和波動(dòng)性促進(jìn)了分子的擴(kuò)散速度[19]，從而促進(jìn)骨中油脂的溶出。當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，其脫脂率為76.8%。但當(dāng)超聲功率超過(guò)400 W時(shí)，脫脂率變化減緩，這可能是由于脫脂溶劑的溶脂能力已趨于飽和，400與500、600 W的超聲功率對(duì)脫脂率無(wú)顯著差異（>0.05）。因此，選取400 W為最佳條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

注：圖1a超聲功率300 W，超聲時(shí)間20 min，液料比2；圖1b超聲時(shí)間20 min，液料比2；圖1c超聲功率500W，液料比2；圖1d超聲功率500 W，超聲時(shí)間30 min；不同字母表示差異顯著（P<0.05），下同。

由圖1c可以看出，脫脂率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提高。在超聲時(shí)間為10～30 min時(shí)，脫脂率隨超聲時(shí)間迅速上升，而在30～60 min內(nèi)，脫脂率增加趨勢(shì)變緩。超聲波的作用由表及里，隨著其不斷深入牦牛骨內(nèi)部，油脂的擴(kuò)散率相應(yīng)減少[31]。因此，當(dāng)超聲脫脂達(dá)到一定時(shí)間后，脫脂率增加趨勢(shì)會(huì)減緩。當(dāng)超聲波的作用完全抵達(dá)牦牛骨內(nèi)部時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間則不會(huì)再產(chǎn)生影響。當(dāng)脫脂時(shí)間為30 min時(shí)，脫脂率可達(dá)78.2%，且與40、50、60 min時(shí)的脫脂效果無(wú)顯著差異（>0.05），因此選取30 min為后續(xù)試驗(yàn)的脫脂時(shí)間。

由圖1d可以看出，液料比為2～5時(shí)，脫脂率隨著液料比的增大呈上升趨勢(shì)。這是由于對(duì)于一定質(zhì)量的牦牛骨來(lái)說(shuō)，溶劑用量的增加會(huì)降低溶劑中油脂的濃度，增加牦牛骨與溶劑接觸表面的濃度差，從而促使傳質(zhì)推動(dòng)力的增加[32-35]。當(dāng)脫脂溶劑用量增大到一定程度后，牦牛骨中的大部分油脂已經(jīng)溶出，隨用量持續(xù)增加，油脂溶出漸緩，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，可選擇液料比為5作為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的最適條件。當(dāng)液料比為5時(shí)，其脫脂率與液料比為6、7的脫脂率已無(wú)顯著差異（>0.05），脫脂率可達(dá)84.5%。

2.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)試驗(yàn)以估計(jì)誤差。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，1表示脫脂率。

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，脫脂率（1）與超聲功率（）、超聲時(shí)間（）和液料比（）之間建立二次回歸模型如公式（6）。

1=80.36+3.83+1.29+2.70+0.52+

1.15+1.19+2.032+0.892+0.812（6）

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 回歸方程顯著性分析

為了考察模型的擬合度，尋找主效應(yīng)顯著性以及各因素之間的相互作用，對(duì)回歸方程進(jìn)行ANOVA方差分析，其結(jié)果如表4所示。

從表4中可以看出，該模型的<0.01，值為14.29，說(shuō)明所選模型極顯著；失擬項(xiàng)的>0.05，說(shuō)明其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，該模型在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好；2Adj–2Pre<0.2，說(shuō)明該模型可充分說(shuō)明工藝過(guò)程[36]。方差分析結(jié)果表明，該模型與試驗(yàn)具有較高的擬合度，能很好的反映出各因素與脫脂率之間的關(guān)系。通過(guò)值的檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型一次項(xiàng)、的值小于0.01，對(duì)模型貢獻(xiàn)大，因此其對(duì)脫脂率影響極顯著，而一次項(xiàng)、二次項(xiàng)2的值小于0.05，表明其對(duì)脫脂率影響顯著。此外，交互項(xiàng)、的值小于0.15，是影響脫脂率的重要因子。由檢驗(yàn)可以得出超聲功率、超聲時(shí)間和液料比對(duì)牦牛骨脫脂率都有一定的影響，其因子貢獻(xiàn)率為超聲功率>料液比>超聲時(shí)間，但其交互作用不顯著。

表4 方差分析表

注：***表示極顯著（0.01），* *表示顯著（<0.05），*表示重要因子（<0.15）。

Note: ***represents highly significant (<0.01), **represents significant (< 0.05), *represents important factor (<0.15).

2.2.4 響應(yīng)曲面與等高線分析

依據(jù)回歸擬合函數(shù)以及各因素對(duì)牦牛骨脫脂率的影響，每2個(gè)因素對(duì)牦牛骨脫脂率畫(huà)出響應(yīng)面和等高線圖，考慮到定性分析各因素對(duì)牦牛骨脫脂率的關(guān)系，固定另外1個(gè)因素時(shí)，均作“0”水平處理。圖2為各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。

圖2 AB、AC、BC交互作用對(duì)牦牛骨脫脂率的影響

對(duì)牦牛骨脫脂率影響顯著的因素，表現(xiàn)為等高線密集、曲線較陡，響應(yīng)值變化較大；反之，等高線疏松、響應(yīng)曲面較為平滑，響應(yīng)值變化較小[37]。因此由圖可以判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度為：>>；2因素之間的交互作用較弱，影響程度為：>>；與方差分析結(jié)果一致。

鑒于不能直接從響應(yīng)曲面上找出最佳的工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步分析。利用Design-expert軟件對(duì)所得到的回歸方程進(jìn)一步分析，考慮到能耗，在脫脂率大于91%的情況下選擇能耗最低的最佳工藝參數(shù)：超聲功率499.86 W、超聲時(shí)間30.7 min、液料比5.99，模型預(yù)測(cè)在此條件下的理論脫脂率為91.02%。為驗(yàn)證響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利、成本等因素，修正工藝參數(shù)為：超聲功率500 W、超聲時(shí)間30 min、液料比為6，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。使用上述超聲脫脂條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際牦牛骨脫脂率為92.00%±0.20%，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.08%，誤差較小，表明驗(yàn)證值與模型所得到的預(yù)測(cè)值基本接近，優(yōu)化結(jié)果具有可靠性。

2.3 不同脫脂方式結(jié)果分析

2.3.1 脂肪、蛋白質(zhì)和膠原蛋白含量比較分析

將牦牛骨分別采用超聲波法和蒸煮法進(jìn)行脫脂處理，獲得結(jié)果如圖3所示。根據(jù)公式（1），超聲波法和蒸煮法所獲得的牦牛骨脫脂率分別為92.00%、71.25%；經(jīng)脫脂處理后，牦牛骨中總蛋白具有不同程度的流失，由公式（2）、（3）計(jì)算得超聲波法和蒸煮法蛋白流失率分別為8.11%、13.28%，其中膠原蛋白流失率分別為11.05%、18.40%。2種不同處理方法都會(huì)對(duì)牦牛骨中蛋白質(zhì)造成一定程度的流失，牦牛骨經(jīng)超聲波處理后，其中部分與酯類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)隨著油脂的溶出而流失；除與酯類(lèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)，牦牛骨中還存在少量水溶性蛋白質(zhì)，并且高溫高壓條件下蛋白質(zhì)三螺旋結(jié)構(gòu)解體，骨組織被破壞，導(dǎo)致牦牛骨蛋白質(zhì)流失率增大[38]。

圖3 不同脫脂方法對(duì)牦牛骨中脂肪含量、總蛋白含量以及膠原蛋白含量的影響

2.3.2 礦物質(zhì)含量比較

利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)經(jīng)2種方法處理的脫脂牦牛骨中P、Ca等12種礦物質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果如表5所示。經(jīng)高壓蒸煮處理的牦牛骨中Na、K、Fe、Mn等元素流失嚴(yán)重，根據(jù)公式（4）計(jì)算得流失率分別可達(dá)19.00%、58.95%、14.32%、20.86%，這可能由于牦牛骨經(jīng)過(guò)高壓高溫處理后，部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解體，骨組織變得疏松多孔，礦物質(zhì)得以釋放并以離子形式游離到水中[37]而流失；經(jīng)超聲波處理的牦牛骨，F(xiàn)e、Zn、Mn等元素亦存在流失現(xiàn)象，流失率分別為18.66%、2.18%、15.04%，這可能與乙酸乙酯具有一定溶解金屬元素的能力有關(guān)。但2種脫脂牦牛骨中P、Ca、Mg、Cu、Se、Mo、Sr等元素與原料骨中的含量無(wú)明顯差異，這可能由于該類(lèi)元素存在于羥基磷灰石中并與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，很難以離子的形式游離出來(lái)。由此，與高壓蒸煮相比，超聲脫脂法能顯著降低礦物質(zhì)流失率（<0.05），能夠更大程度地保留骨粉中的礦質(zhì)元素。

表5 礦物質(zhì)含量

注：結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，a～c為不同樣品間存在顯著差異（<0.05）。

Note: Results are indicated by mean ± standard deviation, and a-c indicate significant differences between different samples at 0.05 level.

2.3.3 牦牛骨微觀形態(tài)觀察

選取經(jīng)不同方法處理的牦牛骨，并對(duì)其股骨頭和股骨體2部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，掃描電鏡結(jié)果如圖4所示。經(jīng)2種方法處理后，牦牛骨在油脂減少的同時(shí)，其結(jié)構(gòu)由致密、規(guī)則變得疏松、多孔。經(jīng)超聲脫脂處理后，一方面分布在骨結(jié)構(gòu)中的油脂被溶出，使縫隙、孔洞等原有結(jié)構(gòu)更明顯突出，另一方面由于超聲波所具有的空化效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)作用，使骨結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的疏松，孔隙增加。經(jīng)蒸煮脫脂處理后，股骨體孔洞明顯增加，股骨頭產(chǎn)生一定程度的破碎，這可能是由于高溫打斷了膠原蛋白分子內(nèi)氫鍵使其三螺旋結(jié)構(gòu)解體[39]，并進(jìn)一步破壞了與礦物質(zhì)的結(jié)合[40]，這也可能是造成礦質(zhì)元素流失嚴(yán)重的原因之一。

2.4 不同脫脂方式制備骨粉結(jié)果分析

2.4.1 骨粉粒徑分布及微觀形態(tài)比較分析

利用粒度分析儀對(duì)經(jīng)2種方法處理制備的牦牛骨粉進(jìn)行粒徑分布比較分析，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)球磨后，超聲脫脂牦牛骨粉中值粒徑為(35.84±0.60)m，90%顆粒分布在75m以?xún)?nèi)；蒸煮脫脂牦牛骨粉中值粒徑為(11.73±0.29)m，90%顆粒分布在40m以?xún)?nèi)。蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑要顯著小于超聲脫脂牦牛骨粉，分布寬度窄，這是因?yàn)殛笈９墙?jīng)高壓高溫處理后，其結(jié)構(gòu)遭到破壞，變得更為疏松多孔，從而更利于超微粉碎的進(jìn)行[24]。

圖4 不同脫脂方法對(duì)牦牛骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖5 牦牛骨粉粒度分布及微觀形態(tài)比較分析

對(duì)經(jīng)2種方法處理的牦牛骨粉進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果如圖5b、5c所示。蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑較小，分布更均勻，大多呈現(xiàn)橢圓形，形狀更加規(guī)則；超聲脫脂牦牛骨粉粒徑分布范圍較廣，存在形狀不規(guī)則的大顆粒。與牦牛骨掃描電鏡圖和粒徑分布圖結(jié)果一致。

2.4.2 骨粉化學(xué)結(jié)構(gòu)及鈣離子釋放度分析

傅里葉紅外圖譜是區(qū)分物質(zhì)差異的一種有效手段。紅外光譜分為600～1 300 cm–1的指紋區(qū)和1 300～4 000 cm–1的官能區(qū)。官能區(qū)為高頻區(qū)，通常被用來(lái)檢測(cè)物質(zhì)中官能團(tuán)的種類(lèi)以及變化[41]；指紋區(qū)可反映出單鍵的伸縮振動(dòng)和變形振動(dòng)，吸收峰因分子結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生差異[42]。

對(duì)經(jīng)2種不同方法處理的牦牛骨粉進(jìn)行傅里葉紅外掃描分析，結(jié)果如圖6所示。872 cm–1是CO32–的彎曲振動(dòng)吸收峰，為CO32–進(jìn)入羥基磷灰石晶格取代PO43–的特征吸收峰[27,43-44]，1 450、1 512 cm–1是CO32–的拉伸振動(dòng)吸收峰[45]，1 026 cm–1為PO3–1的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)[46]；1 238 cm–1屬酰胺Ⅲ帶，是C–N伸縮振動(dòng)和N–H彎曲振動(dòng)，以及甘氨酸主鏈脯氨酸側(cè)鏈上–CH2的非平面搖擺振動(dòng)的特征吸收峰；1 600～1 700 cm–1多肽主鏈上C=O伸縮振動(dòng)，1 647 cm–1屬酰胺I帶吸收峰；1 743 cm–1為酯類(lèi)C=O伸縮振動(dòng)峰，為骨油吸收峰[43]；2 854和2 927 cm–1的吸收峰是C–H有機(jī)物拉伸振動(dòng)吸收峰[43, 47]。

由圖6a可得，2種脫脂牦牛骨粉化學(xué)結(jié)構(gòu)大體相同，皆以磷酸鹽和碳酸鹽為主，含有少量的有機(jī)物；超聲脫脂牦牛骨粉在1 743、2 853、2 922㎝–1處無(wú)明顯峰值，這可能是由于其油脂去除完全，而蒸煮脫脂牦牛骨粉中殘留脂肪高，出現(xiàn)明顯峰值。

通過(guò)對(duì)牦牛骨粉鈣離子釋放度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式（5），結(jié)果顯示二者鈣離子釋放度無(wú)顯著差異（>0.05）（如圖6b所示）。研究表明75m牦牛骨粉鈣離子釋放度大于100m骨粉鈣釋放度[38]，但小于75m牦牛骨粉不同粒徑之間鈣離子釋放度是否存在差異尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，牦牛骨經(jīng)超聲脫脂和蒸煮脫脂后制備2種脫脂骨粉的中值粒徑分別為35.84和11.73m，兩者分布寬度窄、差距相對(duì)較小，因而可能導(dǎo)致其鈣離子釋放度差異不顯著（>0.05）。這一結(jié)果同樣表明利用高效超聲脫脂工藝處理制備的牦牛骨粉粒徑雖然大于蒸煮脫脂牦牛骨粉粒徑，但并不會(huì)顯著影響鈣離子釋放度（> 0.05），說(shuō)明該種脫脂工藝具有可行性。另外，蒸煮脫脂牦牛骨粉的脂肪含量顯著高于超聲脫脂牦牛骨粉（如圖3所示），較高殘留脂肪可能會(huì)影響鈣離子的釋放，從而導(dǎo)致2種骨粉的鈣離子釋放度沒(méi)有顯著差異（>0.05）。

圖6 牦牛骨粉化學(xué)結(jié)構(gòu)及鈣離子釋放度

3 結(jié) 論

本文通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)牦牛骨超聲脫脂參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并比較分析了超聲脫脂法和蒸煮脫脂法對(duì)制備骨粉的影響，得出以下結(jié)論：

1）超聲脫脂參數(shù)優(yōu)化各因素對(duì)脫脂率的影響順序?yàn)椋撼暪β?液料比>超聲時(shí)間，其中超聲功率和液料比對(duì)脫脂率有極顯著影響，但兩兩因素間無(wú)明顯交互作用；超聲脫脂的最佳參數(shù)：超聲功率500 W、超聲時(shí)間30 min、液料比為6，在此條件下脫脂率為92.00%± 0.20%。

2）超聲脫脂率顯著高于蒸煮脫脂率（<0.01），超聲脫脂可以更大程度地保留蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分（< 0.01）。

3）超聲脫脂后制得骨粉中值粒徑（35.84±0.60）m高于蒸煮脫脂后制得骨粉中值粒徑（11.73±0.29）m；2種骨粉化學(xué)結(jié)構(gòu)和鈣離子釋放度不存在顯著差異。

該研究提供了一種高效脫脂的方法，為改善牦牛骨和其他畜禽骨骨粉加工工藝及提高骨粉品質(zhì)提供參考。

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Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder

Qin Xiaojie1, Shen Qingshan1, Jia Wei1, Zhang Chunhui1,2※, Zheng Qiankun2

(1.100193,2.262216)

In order to reduce the degreasing rate and improve the quality of yak bone powder, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method was studied based on the thighbone of Qinghai yak in this paper, and the nutrient contents and physicochemical properties were analyzed comparing with the traditional boiling degreasing method. Firstly, the degreasing solvent was screened according to degreasing rate and applicability among four common organic solvents. Basing on the single factor test, Box-Behnken test was designed to optimize the parameters including ultrasonic power, degreasing time and the ratio of liquid to material. After that, the analysis of the degreasing rate, the loss rate of protein, collagen, main minerals and the microstructure of yak bone treated by ultrasonic and boiling was carried out. Subsequently, the particle size distribution, microstructure, chemical structure and calcium release rate of yak bone powder dealt with the planetary ball mill were shown as well. Results suggested that ethyl acetate was the optimal degreasing solvent with a higher degreasing rate and better applicability under the same conditions. In addition, the two regression model built by response surface design had a good fitting degree with the correlation coefficient of 0.9484 indicating that the model fitted well in the whole regression region.Considering the energy consumption, the optimum degreasing conditions were finally determined as follows: ultrasonic power is 500 W, ultrasonic time is 30min, and the ratio of liquid to material (mL/g) is 6, under which conditions the degreasing rate could reach 92.00%±0.20% and the relative error of the predicted value was 1.08% which was less than 5% revealing that the model was effective. Besides that, it was also found that the degreasing rate of ultrasonic (92.00%±0.20%) was significantly higher than that of boiling method (71.25%±2.31%) (<0.05). Meanwhile, the loss rate of protein and collagen were 8.11%±0.48%, 11.05%±2.45%, respectively, which were dramatically lower (<0.05). And there was a serious loss of Na, K, Fe, Mn in cooked yak bone that were 19.00%±1.44%, 58.95%±1.04%, 14.32%±2.46% and 20.86%±1.29% respectively while the loss about Fe, Zn, Mn in ultrasonic skimmed yak bone was slightly, and the contents of P, Ca, Mg, Cu, Se, Mo, Sr in the bone treated with the two methods were similar (>0.05). As for the microstructure of yak bone, the boiling one was looser and more porous. After pulverization, the median diameter of ultrasonic defatted bone powder was (35.84±0.60)m while the other was (11.73± 0.29)m, which was in agreement with the result of scanning electron microscope. Moreover, no significant difference had been observed in the chemical structure, and there were mainly phosphate and carbonate in two kinds of bone powder. For the calcium release rate of bone powder, result indicated that both methods had no significant difference (>0.05). In conclusion, the ultrasonic assisted organic solvent degreasing method could remain more nutrients with the higher degreasing rate. This study provided a high efficient degreasing method, which has the value for improving the processing technology for preparing the yak bone powder.

ultrasonic; degreasing; solvent; yak; bone powder; boiling

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034

TS251.9

A

1002-6819(2018)-21-0272-09

2018-06-01

2018-09-19

西藏自治區(qū)重點(diǎn)科研項(xiàng)目“特色農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)”；國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目；鳶都產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才資金資助。

秦曉潔，研究方向：畜產(chǎn)品加工利用。 Email：13521156962@163.com

張春暉，研究員，研究方向：肉品科學(xué)。Email：r_zch@163.com

秦曉潔，沈青山，賈 偉，張春暉，鄭乾坤.超聲輔助脫脂對(duì)牦牛骨粉制備及其理化特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2018，34(21)：272－280. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org

Qin Xiaojie, Shen Qingshan, Jia Wei, Zhang Chunhui, Zheng Qiankun. Effect of ultrasonic-assisted degreasing on preparation and physicochemical properties of yak bone powder [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(21): 272－280. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.034 http://www.tcsae.org