2012年—2015年安徽省H9N2禽流感病毒抗原變化分析

胡曉苗，張丹俊，戴 銀，趙瑞宏，潘孝成，周學利，侯宏艷，沈?qū)W懷，朱傳明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)易發(fā)生點突變引起抗原漂移，不同亞型毒株同源重組，引起抗原頻繁變異，產(chǎn)生眾多血清亞型[1]。因此，對禽流感的有效防控一直都面臨極大的挑戰(zhàn)。H9N2亞型AIV在中國家禽中呈地方流行性并呈蔓延趨勢，如果繼發(fā)感染其他病原，則病死率大大升高，同時還可作為H5N1、H7N9和H10N8的新型人類禽流感病毒的基因供體，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全[2-4]。國內(nèi)已經(jīng)使用Ck/SD/6/96和Ck/SH/F/98等作為疫苗株[5]來防控H9N2禽流感。然而，在巨大的疫苗壓力和環(huán)境選擇下，H9N2病毒在已經(jīng)接種疫苗的雞群中仍然不斷發(fā)生著抗原漂移[6-9]，人們迫切需要了解當前流行毒株的抗原特性和常用疫苗對這些病毒的保護效率。

本試驗選取2012年—2015年我國安徽省分離的24株H9N2亞型AIV進行HA基因序列測定、遺傳演化分析和抗原位點分析，選取1株流行株與疫苗株F98進行抗原差異分析，以了解當前H9亞型AIV變異動向及抗原性變化，為H9禽流感疫苗的評估和使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和雞胚 本試驗中使用的24株H9N2亞型AIV分離毒株，2012年—2015年間自安徽省家禽養(yǎng)殖場和活禽市場中分離；疫苗毒株為 A/chicken/Shanghai/F/98(F株)[8]，揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室提供；無特定病原體(SPF)種蛋，購自北京梅里亞公司，由安徽農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室實驗室孵育至9日齡～11日齡。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；RNA酶A、dNTPs、DNA Marker、RNA提取試劑盒、DNA Gel Extraction Kit (AxyPrep)，Axygen公司產(chǎn)品；RNA酶抑制劑(RNasin)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.1.3 引物 反轉(zhuǎn)錄引物為5′-AGCAAAAGCAGG-3′;HA基因擴增的通用引物1對，P1：5′-AGCGAAAGCAGGGG-3′;P2：5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′;引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 擴增HA基因片段 用病毒RNA提取試劑盒抽提病毒總RNA。用反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶(A-MLV)對病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA。以cDNA為模板進行PCR，HA基因擴增的通用引物P1/P2特異性擴增出HA基因片段。將PCR回收產(chǎn)物連同PCR引物，送金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2 HA基因的測序和遺傳進化樹繪制 含HA基因的PCR產(chǎn)物由南京金斯瑞有限公司測序。采用Lasergene 7.1軟件進行HA基因序列編輯和翻譯；用Mega5.1軟件繪制遺傳進化樹。

1.2.3 流行株A/chicken/Anhui/20150416/2015和疫苗株F98滅活疫苗的交叉免疫保護試驗 收集A/chicken/Anhui/20150416/2015(AH0416)和F98毒株感染雞胚的尿囊液，用3.5 mg/mL甲醛滅活72 h，與白油混和均勻，制成油乳劑疫苗。將36只3周齡SPF雞隨機分為6組，每組6只，隔離飼養(yǎng)；其中2組接種F98株禽流感滅活油乳疫苗(0.2 mL/只)，2組接種H9亞型流行株AH0416株禽流感滅活油乳疫苗(0.2 mL/只) ，另外2組接種滅菌PBS (0.2 mL/只)作為對照。21 d后采集各組雞的血清，分別以F98和AH0416作為抗原，測定血凝抑制 (HI) 抗體效價(以log2表示)；免疫同種疫苗的2組動物分別用F98和AH0416毒株經(jīng)鼻腔途徑攻毒，同時接種PBS對照組，劑量為每只雞106EID50/0.1 mL。攻毒后第3、5、7天，采集喉頭和泄殖腔拭子樣品。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測排毒情況 用試劑盒提取交叉免疫保護試驗所采集棉拭子樣品中的病毒RNA，用TaqMan-MGB實時熒光定量PCR檢測樣品中是否存在H9N2病毒的核酸，參照文獻[10]實施。分別統(tǒng)計各組雞的排毒情況。

2 結(jié)果

2.1 HA基因的序列分析

對24株分離株HA基因測序分析顯示，HA基因全長為1 683 bp，共編碼560個氨基酸，與H9亞型禽流感病毒華東地區(qū)經(jīng)典株A/Chicken/Shanghai/F/98(F98)相比，無核苷酸的插入或缺失。本研究24個毒株HA基因核苷酸同源性在94.5%～99.9%之間，與Dk/HK/Y280/97的核苷酸序列及其推導出的氨基酸同源性分別在90.5%～94.8%和91.6%～95.8%之間，與Ck/SH/F/98的核苷酸序列及其推導出的氨基酸同源性分別在89.8%～91.6%和92.0%～93.8%之間，相比較而言，本研究的24個毒株HA基因與Dk/HK/Y280/97(Y280-lik)的同源性更高，說明與Y280-like的遺傳距離更近，具有相同起源。

根據(jù)完整的HA基因編碼的氨基酸序列繪制HA基因的遺傳進化樹，由圖1可看出，本研究的所有毒株均屬于Y280-like。但是，除了2株2014年的分離株外，所有分離株都聚集在與Y280-like遺傳進化距離較遠的分支上，與上述氨基酸同源性分析結(jié)果一致，說明H9N2亞型病毒在中國正持續(xù)進化，趨于形成穩(wěn)定的分支。2012年—2015年的毒株在遺傳進化樹上的分布較集中，說明病毒之間的遺傳進化距離比較近，在這4年間病毒并未發(fā)生大的遺傳變異。但與常用的疫苗株F98已有了較大的遺傳差異。

2.2 HA基因抗原位點變異分析

在24株H9N2禽流感病毒HA1所有變異的氨基酸中包含部分抗原位點。本研究以文獻[11]人H3亞型流感病毒A/Achi/2/68毒株的HA基因氨基酸序列作為參照，推導并比較了本研究毒株HA基因的幾個關(guān)鍵位點的氨基酸序列，再根據(jù)A/Swine/HongKong/8/98 HA晶體結(jié)構(gòu)模型[12]，對這些毒株HA1的變異位點進行歸類，結(jié)果表明，2012年—2015年間發(fā)生禽流感病毒的氨基酸位點變異主要集中在與H3亞型相對應(yīng)的C、D和E 3個抗原變異區(qū)，而A和B位點相對保守(表1)。

◆.毒株；●.F98疫苗株；▲.Y280株；◇.試驗用株

◆.Strains; ●.F98 vaccine strain; ▲.Y280 strain; ◇.Experiment strain

圖1 HA基因遺傳進化樹

2.3 交叉免疫保護試驗

AH0416于2015年從雞體分離，根據(jù)HA基因遺傳進化樹顯示，該分離株與F98的遺傳距離最遠,且為近年分離的毒株，故選取其與疫苗株F98進行交叉免疫保護試驗，評價流行株抗原性的變化。對3周齡SPF雞接種H9亞型AH0416株禽流感滅活疫苗21 d后，產(chǎn)生的針對AH0416株和F98株的HI抗體效價分別為8.36 log2和7.16 log2，接種H9亞型F98株疫苗21 d后，產(chǎn)生的針對AH0416株和F98株的HI抗體效價分別為7.53 log2和 8.09 log2(表2)。結(jié)果表明,H9滅活疫苗免疫，均能誘導產(chǎn)生較高的中和免疫毒株的血清抗體(大于8 log2)，但對遺傳距離較遠的異源病毒的中和效價要低1個～2個滴度，說明隨著H9N2病毒不斷進化，其抗原性也隨之發(fā)生改變。

表2 F98與AJ3株之間交叉血凝抑制結(jié)果

H9病毒滅活苗對SPF雞的保護效率見表3。F98株攻毒后，F(xiàn)98疫苗可以保護SPF雞不排毒，免疫組攻毒第3天的喉頭排毒率為33.33%(2/6)，泄殖腔排毒率為33.33%(2/6)；第5天的喉頭排毒率為16.67%(1/6)，泄殖腔排毒率為33.33%(2/6)，第7天停止排毒；PBS對照組第3天喉頭和泄殖腔的排毒率為100%(6/6)，第5天喉頭的排毒率為50%(3/6)，泄殖腔排毒率為100%(6/6)。AJ3株攻毒后，AH0416疫苗可以保護SPF雞不排毒；F98株攻毒第3天的喉頭排毒率為33.33%(2/6)，泄殖腔排毒率為1/6;第5天的喉頭排毒率為16.67%(1/6)，泄殖腔排毒率為50%(3/6)，第7天停止排毒；PBS對照組第3天喉頭和泄殖腔的排毒率為100%(6/6)，第5天喉頭的排毒率為50%(3/6)，泄殖腔排毒率為83.33%(5/6)(表3)。排毒情況與交叉血凝試驗結(jié)果一致，證明流行株的抗原性已經(jīng)發(fā)生了變化，F(xiàn)98疫苗對其無法提供完全保護。

3 討論

近年來，國內(nèi)有報道認為當前H9N2亞型AIV流行毒株已經(jīng)發(fā)生了顯著變化， 現(xiàn)有疫苗已經(jīng)不能產(chǎn)生完全免疫保護[13]。本研究對2012年—2015年期間從安徽地區(qū)雞群分離的24株流行毒株所進行的HA基因測序分析，結(jié)果24株與Dk/HK/Y280/97的同源性更高，與Y280-like的遺傳距離更近，具有相同起源。根據(jù)HA基因ORF編碼的氨基酸序列繪制HA基因的遺傳進化樹，本研究的所有毒株均屬于Dk/HK/Y280/97-like，但與Dk/HK/Y280/97遺傳進化距離比較遠。除了2014年的2株與Y280遺傳距離較近之外，其他毒株都聚集在較遠的獨立分支，說明2012年—2015年的H9N2病毒正在不斷進化，近年來形成的分支與之前的Y280株已有了較大的遺傳差異。對這些毒株HA1的變異位點進行歸類，結(jié)果表明，發(fā)生的氨基酸變異位點主要集中在與H3亞型相對應(yīng)的C、D和E3個抗原變異區(qū)，共有28個氨基酸發(fā)生變化，預(yù)示著流行株的抗原特性可能發(fā)生了一些改變。

為了研究當前流行株與疫苗株F98之間的抗原差異，本研究選取一株遺傳進化樹中距離F98株最遠的分離株AH0416，用其和F98株進行交叉免疫保護試驗。發(fā)現(xiàn)滅活疫苗免疫對同種病毒可以提供完全保護，而不能完全阻斷異種H9N2病毒的排毒。表明當前的流行毒株AH0416是一株抗原變異株，在基因水平上發(fā)生的變異已經(jīng)累計到抗原性的變化，常用的疫苗已經(jīng)不能提供完全保護。加強對H9N2亞型禽流感病毒生物學特性和分子流行病學研究，掌握其遺傳變異規(guī)律，研發(fā)合適的新型疫苗，對于科學防控H9N2禽流感意義重大。

表3 H9病毒滅活疫苗對SPF雞的保護效率

注：C.泄殖腔，T.喉頭。

Note：C.Cloaca，T.Larynx.