牛布魯菌熒光標記免疫層析試紙條快速檢測方法的建立

劉佳佳，吳 彤，梅 琳，韓雪清，吳紹強，林祥梅，王慧煜*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.內(nèi)蒙古開魯縣家畜改良工作站，內(nèi)蒙古開魯 028400)

布魯菌病(Brucellosis)(簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的重大人畜共患病，以侵害動物生殖系統(tǒng)，引起動物流產(chǎn)和不孕不育為特征[1]。進入21世紀，布魯菌病疫情日趨加重，呈現(xiàn)從牧區(qū)、半牧區(qū)向農(nóng)區(qū)甚至城市蔓延的趨勢，被WHO稱為“再度肆虐”的傳染病。包括美國等發(fā)達國家在內(nèi)的170多個國家和地區(qū)都發(fā)生過或正在發(fā)生布病，這些國家大都與我國有貿(mào)易往來，更為嚴重的是我國周邊國家疫情頻頻發(fā)生(如蒙古國、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦等)[2-3]，給我國布魯菌病防控帶來新的挑戰(zhàn)。

我國針對動物布魯菌病的防控以檢疫、撲殺和免疫綜合治理為主，布魯菌病的快速、準確診斷可為疫病防控提供有效的疫情信息，是早期防控的關鍵。細菌學診斷方法作為布魯菌病診斷的金標準，結(jié)果雖然具有較高的精確度，但是易污染、耗時長，且不易分離，并且對工作人員的威脅較大。基于檢測布魯菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的血清學診斷方法，如虎紅平板凝集試驗(rose-bengal plate agglutination test，RBPT)和補體結(jié)合試驗(complement fixation test，CFT)，是世界范圍內(nèi)較為認可的方法[4-5]，但因存在實驗操作步驟繁瑣、費時，在大量樣品的實地檢測中應用較少。而基于布魯菌全菌作為抗原的ELISA檢測方法亦不適合現(xiàn)場檢測[6]。因此，建立一種快速并適合現(xiàn)場使用的診斷方法非常必要。研究發(fā)現(xiàn)布魯菌外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)在免疫和診斷方面有著顯著的優(yōu)勢，可作為替換LPS的診斷抗原[7-8]。其中，OMP22作為一種免疫優(yōu)勢抗原，在各種屬之間的保守性很高，是布魯菌重要的毒力因子，是制造疫苗和抗體必不可少的抗原。

免疫層析技術作為發(fā)展較為迅速的快速檢測技術之一，以其簡便、快速、特異性強、易于肉眼判斷、不需輔助儀器和試劑、結(jié)果易于保存等特點，特別適合基層和現(xiàn)場初篩使用。其中，以熒光物質(zhì)作為標記物的免疫層析試紙條，因其特有的光電磁信號放大系統(tǒng)可以提高檢測的靈敏度，減少樣品底色干擾，不存在膠體金顯色難的問題，展現(xiàn)出更廣的發(fā)展前景[9-10]。本研究采用原核表達的牛布魯菌OMP22蛋白作為檢測抗原，以帶熒光標記的抗體作為標記物，建立一種布魯菌熒光標記免疫層析試紙條檢測方法，以期為基層單位在現(xiàn)場快速準確初篩牛布魯菌病提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與血清 pCold-TF/OMP22原核重組表達質(zhì)粒為中國檢驗檢疫科學研究院動檢所構(gòu)建保存；牛布魯菌標準陰性、陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛結(jié)核病血清、牛藍舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、牛口蹄疫血清、牛巴氏桿菌病血清、牛白血病血清，中國檢驗檢疫科學研究院動檢所保存。

1.1.2 主要試劑 熒光標記羊抗牛IgG，上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司產(chǎn)品；兔抗羊IgG，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；玻璃纖維(GF-08)、玻璃纖維墊(8964)、吸水紙(H-5076)、黑色底板(國產(chǎn))和硝酸纖維素膜(HFC13502)，上海捷寧生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 三維噴點系統(tǒng)(Biodot-XYZ3050TM)、切紙機系統(tǒng)(Biodot-CM4000TM)，百道貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；手持式紫外燈(BG-42-A)由中國檢驗檢疫科學研究院提供；超純水系統(tǒng)，美國Milipore公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9030A)，上海中友儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的表達與純化 將pCold-TF/OMP22原核重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落接種至含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌至菌液OD 600 nm值為0.6左右，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集菌液。

收集誘導后的菌體沉淀，加入結(jié)合緩沖液重懸菌體后進行超聲破碎至菌液澄清透明，于4℃離心后，取上清過層析柱(按照QIAGEN公司的NI-NTA agrose說明書進行操作)。先以含低濃度咪唑(10、20、50 mmol/L)的緩沖液洗脫去除雜蛋白，再以含250 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。

1.2.2 重組蛋白的反應原性鑒定 將純化好的OMP22蛋白(蛋白濃度1 μg/mL)，以每孔100 μL的量包被于酶標板上，4℃過夜。用100 mL/L馬血清室溫封閉1 h，以1∶100稀釋的布魯菌標準血清作為一抗，以1∶20 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗牛IgG作為二抗進行重組蛋白的ELISA反應原性分析。最后，用TMB底物顯色液室溫避光反應10 min，用硫酸溶液終止顯色反應，讀取OD 450 nm值。

1.2.3 熒光標記免疫層析試紙條的組裝

1.2.3.1 樣品墊和結(jié)合墊的預處理 將樣品墊和結(jié)合墊浸泡在含有表面活性劑10 g/L Triton100和30 g/L BSA的PBS(pH 7.4)緩沖液中，于4℃條件下浸泡2 h，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)的反應性鑒定 將熒光標記羊抗牛IgG噴涂在結(jié)合墊上，兔抗羊IgG包被在NC膜上，利用濕法將蒸餾水滴加到樣品墊位置去爬膜，觀察C線的顯色情況。若C線出現(xiàn)，表明整個試紙條層析過程是有效的；若未出現(xiàn)，表明該反應失敗。

將熒光標記羊抗牛IgG噴涂在結(jié)合墊上，OMP22蛋白包被在NC膜上，利用濕法將牛布魯菌標準陽性血清滴加到樣品墊位置去爬膜，觀察T線的顯色情況。若T線出現(xiàn)，說明陽性血清中的抗體與熒光標記抗體結(jié)合形成復合物后，又與T線上包被的牛布魯菌重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，表明該試紙條具有檢測能力。

1.2.3.3 抗體濃度的優(yōu)化 結(jié)合墊上熒光標記抗體濃度及C線包被的二抗?jié)舛仁怯绊憻晒庑盘枏娙醯臎Q定因素，可檢測到最小熒光信號的量為試紙條包被抗體的最佳用量。根據(jù)棋盤法原理，使用濃度為1.5 、0.75、0.375 mg/mL的熒光標記羊抗牛IgG，和濃度為0.500、0.250、0.125 mg/mL的兔抗羊IgG兩兩組合進行包被，具體優(yōu)化方案見表1。

表1 熒光標記羊抗牛IgG與兔抗羊IgG的濃度梯度

1.2.3.4 硝酸纖維素膜的預處理 將劃好C線∶兔抗羊IgG和T線∶OMP22蛋白的NC膜置于37℃烘箱中干燥2 h后，用含10 g/L BSA和5 mL/L Tween 20的PBS(pH 7.4)緩沖液浸泡2 h，于37℃烘箱中干燥4 h后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.5 試紙條的組裝及結(jié)果判定 在水平桌面，將包被有T線和C線的NC膜按照黏性PVC(300 mm×60 mm)底板劃分好的位置黏貼，要求左右對齊，不要超出所劃分的NC膜所在位置，然后輕輕抹平膜面；將裁剪成300 mm×2 mm的包被有熒光標記抗體的玻璃纖維素膜，在NC膜的左側(cè)壓住NC膜1 mm處，黏貼到PVC底板上；將300 mm×19 mm的作為樣品墊的玻璃纖維素膜，在結(jié)合墊左側(cè)并壓住結(jié)合墊1 mm處，黏貼到PVC底板上；最后，將300 mm×16 mm吸水墊靠NC膜右側(cè)并壓住NC膜1 mm，黏貼到PVC底板上。用切條機切成4.0 mm寬的試紙條，與干燥劑一起裝人鋁箔袋中密封，于4℃保存。

檢測血清時，T線和C線在紫外燈的照射下均出現(xiàn)紫色線，則為布魯菌抗體陽性；若質(zhì)控線無紫色線出現(xiàn)，則該試紙條無效。

1.2.4 試紙條的敏感性檢測 使用同一批次試紙條檢測稀釋度為1∶10、1∶50、1∶100、1∶200和1∶500的牛布魯菌標準陽性血清，將出現(xiàn)陽性信號的血清最高稀釋度作為試紙條的敏感度。

1.2.5 試紙條的特異性檢測 使用同一批次試紙條分別檢測牛結(jié)核病血清、牛藍舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐濉⑴０褪蠗U菌病血清、牛白血病和牛布魯菌病血清，觀察有無交叉性，判斷試紙條的特異性。

1.2.6 試紙條的重復性檢測 使用同一批次及不同批次的試紙條分別檢測牛布魯菌標準陽性血清和標準陰性血清，根據(jù)試驗結(jié)果評價試紙條的批內(nèi)和批間重復性。

1.2.7 血清樣品的檢測 使用同一批次的熒光免疫層析試紙條對200份牛血清樣品(用PBS緩沖液1∶50稀釋)進行檢測，5 min后記錄結(jié)果。同時以IDEXX試劑盒(標準ELISA檢測方法)作為對比參照，計算兩種檢測方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的純化及ELISA鑒定

由圖1結(jié)果顯示，誘導表達的牛布魯菌重組蛋白OMP22(74 ku)為可溶性表達，經(jīng)NI-NIA agrose親和層析純化后，獲得了純度較高的蛋白。將OMP22作為包被抗原，對牛布魯菌標準陽性和陰性血清進行ELISA檢測，結(jié)果與預期一致，說明該抗原可作為診斷抗原應用于試紙條的研制工作中。

2.2 質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)的反應性

熒光標記羊抗牛IgG和兔抗羊IgG可以發(fā)生特異性結(jié)合反應，C線顯色情況良好。熒光標記羊抗牛IgG可與牛布魯菌病標準陽性血清結(jié)合，并隨著毛細作用繼續(xù)向前流動至T線處，與布魯菌重組外膜蛋白OMP22抗原發(fā)生反應，使T線顯色。

2.3 抗體的最佳濃度

對熒光標記羊抗牛IgG和兔抗羊IgG濃度進行梯度檢測，試紙條T線羊抗牛IgG的最佳標記濃度為0.75 mg/mL，C線兔抗羊IgG的最佳濃度為0.5 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.重組表達菌裂解液上清；2.重組表達菌裂解液沉淀；3.純化的重組蛋白

M.Protein molecular weight Marker; 1.Supernatant of the lysed recombinantE.coliBL21(DE3); 2.Precipiate of the lysed recombinantE.coliBL21(DE3); 3.Purified recombinant protein

圖1重組蛋白OMP22的SDS-PAGE電泳分析

Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein OMP22

2.4 熒光標記免疫層析試紙條檢測結(jié)果

2.4.1 檢測布魯菌抗體結(jié)果 用制作的免疫層析試紙條檢測牛布魯菌病標準陽性和陰性血清，結(jié)果顯示陽性血清呈陽性，陰性血清呈陰性，說明該試紙條具備檢測能力(圖2)。

1.陽性標準血清；2.陰性標準血清1.Positive standard serum; 2.Negative standard serum

2.4.2 特異性檢測 用熒光標記免疫層析試紙條同時檢測牛結(jié)核病血清、牛藍舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐濉⑴０褪蠗U菌病血清、牛白血病和牛布魯菌病血清。結(jié)果顯示，除牛布魯菌病血清呈陽性外，其他均為陰性(圖3)。

2.4.3 敏感性檢測 以OMP22蛋白作為檢測抗原，熒光免疫層析試紙條最低可檢出1∶100稀釋的牛布魯菌病標準陽性血清(圖4)。

2.4.4 重復性檢測 用同一批試紙條分別檢測20份標準陽性血清和20份標準陰性血清，重復3次，得到的結(jié)果保持一致，說明該方法的重復性較好。

2.4.5 樣品檢測結(jié)果 使用IDEXX試劑盒對200份牛血清樣品進行檢測，陽性結(jié)果31份；使用熒光免疫層析試紙條進行檢測，陽性結(jié)果29份。以IDEXX試劑盒的檢測結(jié)果作為標準，試紙條檢出的29份陽性樣品全部來源于31份陽性樣品之中，兩種試驗方法的符合率為93.5%。

1.牛結(jié)核病血清；2.牛藍舌病血清；3.牛病毒性腹瀉血清；4.?？谔阋哐?；5.牛巴氏桿菌病血清；6.牛白血病血清；7.牛布魯菌病血清

1.Bovine tuberculosis serum; 2.Bovine serum of blue tongue disease; 3.Serum of bovine viral diarrhea; 4.Bovine serum of foot and mouth disease; 5.Bovine serum of pasteurellosis; 6.Bovine leukemia serum; 7.Bovine serum of brucellosis serum

圖3試紙條特異性試驗結(jié)果

Fig.3 The specificity test results of test strip

圖4 試紙條敏感性試驗結(jié)果

3 討論

布魯菌病是最重要的人畜共患病之一，其流行與傳播給全世界畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了較為嚴重的威脅，對其防控已成為全球關注的重大社會公共衛(wèi)生問題。血清學診斷方法是布魯菌病常用的診斷方法之一，而以LPS作為包被抗原的ELISA、虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗等方法，由于操作步驟繁瑣、費時，或結(jié)果常常存在假陽性和交叉反應，因此在實際操作中應用較少[11-12]。布魯菌外膜蛋白具有較好的免疫原性和抗原保護作用，在免疫和診斷方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[13-14]。OMP22蛋白作為一種免疫優(yōu)勢抗原，歐建偉等[8]和Martín-Martín A I等[15-16]報道，缺失OMP22基因的綿羊附睪布魯菌在侵染HeLa細胞和J774.A1細胞時，細胞增殖分裂能力有所下降，說明OMP22基因可能與布魯菌的感染力和毒性有關。Caro-Hernández P等[17]也發(fā)現(xiàn)，缺失OMP22基因的B.ovisPA菌株在脾臟的增殖明顯減少、穩(wěn)定期生長不良以及抗體檢測呈陰性等情況。本研究采用NI-NTA agrose親和層析方法純化牛布魯菌OMP22外膜蛋白，并通過ELISA方法驗證其反應性。根據(jù)ELISA方法檢測布魯菌的陽性值最低判定標準，OMP22抗原具有很好的反應原性，可作為診斷抗原應用于牛布魯菌的快速檢測中。

免疫層析技術作為一種可以滿足基層檢疫部門“簡便、準確、易判定”要求的檢測技術，正逐步向定量、高靈敏度、多標記檢測等方向發(fā)展，而免疫層析試紙條是應用于現(xiàn)場快速檢測的必然發(fā)展趨勢。以熒光物質(zhì)作為檢測信號，以其特有的光電磁信號放大系統(tǒng)提高檢測靈敏度，可減少樣品底色干擾因素，既繼承了膠體金免疫層析法操作便捷、可現(xiàn)場檢測的優(yōu)勢，又利用熒光持續(xù)穩(wěn)定的特性，較好地克服了膠體金免疫層析法結(jié)果不穩(wěn)定的缺點，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點[18-19]。因此，本研究采用間接法，將帶熒光標記的羊抗牛IgG噴涂于結(jié)合墊，以純化的布魯菌外膜蛋白OMP22作為抗原包被在NC膜的特定位置作為T線，針對和信號物偶聯(lián)的兔抗羊IgG包被在NC膜的特定位置作為C線，制作檢測布魯菌抗體熒光免疫層析試紙條。結(jié)果表明，該方法特異性好，與牛結(jié)核病血清、牛藍舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、?？谔阋哐?、牛巴氏桿菌病血清、牛白血病血清均無交叉反應；血清樣品檢測結(jié)果與IDEXX試劑盒的符合率為93.5%，說明該方法在實際應用過程中與IDEXX試劑盒ELISA檢測方法的使用效果基本相同，但偶爾也會出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，可能與包被抗原的反應原性不夠好有關，所以仍需要進一步對試驗所用牛布魯菌外膜蛋白進行更好的純化或挑選更加優(yōu)質(zhì)的抗原進行研究。此外，本研究采用間接法制備的試紙條存在熒光信號偏弱的缺點，后續(xù)將制備抗OMP22的單克隆抗體和多克隆抗體，采用夾心法原理，提高熒光信號和試紙條檢測靈敏度。

總之，本研究以牛布魯菌外膜蛋白OMP22作為抗原，制備了診斷牛布魯菌病的熒光標記免疫層析試紙條。該方法操作簡便，不需要特殊的儀器，不需要專業(yè)操作人員，且在短時間內(nèi)即可判斷結(jié)果，基本可以滿足基層獸醫(yī)單位或相關檢疫機構(gòu)快速檢測病原的要求，也為多種疾病聯(lián)檢試紙條的研制和多標本快速定量檢測方法的建立奠定了基礎。