尼帕病毒病的流行現(xiàn)狀與防治研究進(jìn)展

李國(guó)華，王化磊，張 穎，馮 娜，楊松濤，夏咸柱

副粘病毒科病毒能引起人和多種動(dòng)物發(fā)病，其中感染人的主要有麻疹病毒、腮腺炎病毒和風(fēng)疹病毒；感染動(dòng)物的病毒主要有新城疫病毒、犬瘟熱病毒和牛瘟病毒；人獸共患病病毒有亨德拉病毒（Hendra virus, HeV）和尼帕病毒（Nipah virus,NiV）。尼帕病毒?。∟ipah virus disease, NVD）于1998年9月底在馬來西亞霹靂州怡保市附近暴發(fā)，之后又在森美蘭州的兩個(gè)地區(qū)暴發(fā)。該病的臨床表現(xiàn)為高熱、頭痛、腦炎和呼吸系統(tǒng)癥狀，起初被認(rèn)為是乙型腦炎，但采取滅蚊和免疫等措施后，疫情并沒有得到控制。持續(xù)到1999年7月中旬，該國(guó)確診病例至少有265例，其中105例死亡，病死率達(dá)到40%[1]。1999年3月份分離出病毒，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該病毒呈副粘病毒特征。測(cè)序結(jié)果顯示，病毒與HeV同源性高。確診病原后，馬來西亞政府采取措施，撲殺110萬頭豬后未出現(xiàn)新發(fā)病例，成功控制了該病在人群中的流行。2001年NVD分別在印度和孟加拉國(guó)暴發(fā)。截至到目前印度共暴發(fā)3次NVD疫情，分別在2001，2007和2018年。2018年的這次疫情暴發(fā)于5月17日，截止到7月2日，共有19例報(bào)告病例（其中18例為實(shí)驗(yàn)室確診病例），17例死亡（WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)），病死率約94%。而在孟加拉國(guó)，自2001年首次暴發(fā)后，NVD幾乎每年都有暴發(fā)，這可能與該病毒的遺傳特性發(fā)生了變化或居民生活習(xí)俗差異有關(guān)。我國(guó)與印度接壤，并和孟加拉國(guó)鄰近，雖然還沒有病例報(bào)道，但該病具有傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。為此，及早了解NVD的流行現(xiàn)狀和防治研究進(jìn)展，為我們以后成功應(yīng)對(duì)突發(fā)傳染病具有重要意義。

1 病原學(xué)

NiV是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科亨尼帕病毒屬，另一個(gè)同屬的病毒是1994年在澳大利亞布里斯班發(fā)現(xiàn)的HeV[2]。NiV粒子為多形性、球形、絲狀，有囊膜，尺寸在40～1900 nm之間，基因組18 246 nt，比HeV多12個(gè)堿基，編碼至少N、P（C/V）、M、F、G、L 6種蛋白（圖1）。其中N、P、L蛋白結(jié)合在病毒RNA上，與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，M蛋白參與維持病毒囊膜形態(tài)，F(xiàn)、G蛋白參與蛋白的融合和吸附，與病毒入侵有關(guān)[4]。N基因高度保守，可作為PCR診斷的靶片段[1]。NiV主要有2個(gè)遺傳譜系：NiV馬來西亞株（NiV Malaysia, NiV-MY）和NiV孟加拉株（NiV Bangladesh, NiV-BD）。其中NiV-MY株基因組18 246 nt，而NiV-BD株基因組18 252 nt[5]。

圖1 亨尼帕病毒結(jié)構(gòu)圖[3]Figure 1 Structure of Henipa virus[3]

2 流行病學(xué)

NVD病死率高，在40%～75%之間。在1998年9月底—1999年7月中旬馬來西亞暴發(fā)的NVD疫情中，病死率達(dá)到40%[1]。1999年3月，新加坡確診病例11例，死亡1例[6]。之后，印度在2001年、2007年和2018年均暴發(fā)了NVD疫情，孟加拉國(guó)從2001—2012年，幾乎每年均發(fā)生NVD疫情，兩國(guó)2001—2012年疫情病例總數(shù)為280例，死亡 211例，病死率高達(dá)75%[5]。亨尼帕病毒暴發(fā)和果蝠活動(dòng)范圍分布見圖2。

據(jù)調(diào)查NiV的傳染源是果蝠，主要通過兩種方式傳播：一種是傳給中間宿主豬，豬再通過接觸傳染給人；另一種是通過污染椰棗樹的椰棗汁傳染給人[8-9]。另外，健康人與患者密切接觸也可能感染[10]。

圖2 亨尼帕病毒暴發(fā)和果蝠活動(dòng)范圍分布圖[7]Figure 2 Henipa virus outbreaks and Pteropus distribution map[7]

在馬來西亞，NiV主要通過中間宿主傳播。暴發(fā)地居民將豬舍建在果樹旁。果蝠是NiV的主要貯存宿主，感染NiV的果蝠采食樹上的果子時(shí)，其唾液、尿液污染的未吃完的果子和殘?jiān)羧胴i舍后被豬采食，而后豬感染病毒。發(fā)病期的豬的糞便、尿液等分泌物又通過直接接觸感染其他宿主。然而豬的發(fā)病率并不高，在5%左右[1]。人在處理病死豬時(shí)，接觸到病死豬的糞便、分泌物等，經(jīng)過6～21 d的潛伏期后出現(xiàn)高熱、頭痛等腦炎癥狀，有部分患者出現(xiàn)咳嗽等呼吸系統(tǒng)癥狀。臨床上，NVD容易和流行性乙型腦炎混淆，但NiV感染的人不分年齡，嬰幼兒和成年人均可發(fā)病，且病死率高，而流行性乙型腦炎主要感染兒童，感染后病死率低，這是兩者的區(qū)別[4]。感染者與豬密切相關(guān)，馬來西亞的感染者主要是養(yǎng)殖場(chǎng)工人，新加坡的感染者全都是屠宰場(chǎng)工人。

孟加拉國(guó)和印度疫情暴發(fā)主要是居民飲用了被NiV污染的椰棗汁。該地區(qū)的居民具有飲用椰棗汁的傳統(tǒng)，常在秋冬季采集新鮮椰棗汁直接飲用或發(fā)酵后飲用。為了收集椰棗汁，居民先將椰棗樹削皮，然后插入引流管過夜收集汁液。椰棗汁口感甜美，果蝠夜間常來舔食樹干上的汁液，當(dāng)NiV陽性果蝠的分泌物如唾液、尿液、糞便等落入椰棗汁中，人飲用后會(huì)導(dǎo)致感染發(fā)病[12]，疫情暴發(fā)多集中在9月到來年3月間。

人際間傳播是NVD在孟加拉國(guó)和印度流行的又一大特征。2001年印度西里古里暴發(fā)的NVD疫情顯示，先后感染的病例集中在患者去過的醫(yī)院，該次疫情死亡45例（確診66例）[12]。2004年孟加拉國(guó)福里德布爾的疫情中，當(dāng)?shù)匾粋€(gè)知名的宗教領(lǐng)袖感染NiV后，探望者眾多，導(dǎo)致22人感染[9]。Luby等[13]統(tǒng)計(jì)了2001—2007年間孟加拉國(guó)的病例，其中51%（62例）的病例是密切接觸其他患者后感染了NiV。調(diào)查發(fā)現(xiàn)呼吸道分泌物是人際傳播病毒的主要載體，而且呼吸困難的患者更容易傳播病毒[11，13-14]。

副粘病毒大多數(shù)成員感染動(dòng)物有特異性，一般不跨物種感染。但NiV能感染多種動(dòng)物，如豬、馬、貓、狗等均可感染。NiV宿主范圍廣是因?yàn)樗愿闻涞鞍譈2/B3（ephrin B2/B3）作為進(jìn)入細(xì)胞的受體，肝配蛋白B2/B3參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和紅細(xì)胞的發(fā)育，廣泛分布在內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞表面，而且在哺乳動(dòng)物中高度保守[5，15-16]。

孟加拉國(guó)頻繁發(fā)生NVD疫情，可能跟病毒遺傳特性和發(fā)生改變的傳播方式有關(guān)。Mire等[17]用非洲綠猴攻毒實(shí)驗(yàn)顯示NiV-BD株致病力強(qiáng)于NiV-MY株。這提示我們?cè)诮佑|到疑似病例時(shí)要注意做好個(gè)人防護(hù)。Harcourt等[18]分析了NiVMY和NiV-BD株病毒，兩者全基因序列同源性為91.8%，編碼蛋白區(qū)的序列同源性比非編碼區(qū)高。4株孟加拉國(guó)分離株的N基因開放閱讀框序列同源性為99.1%，而馬來西亞分離株不同株之間的同源性幾乎完全一致，基因上的這些差異可能反映了疫病在兩個(gè)國(guó)家傳播模式的不同。

3 臨床癥狀

馬來西亞和新加坡患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、頭暈和嘔吐，52例（55%）患者意識(shí)水平下降，明顯表現(xiàn)出腦干功能障礙。典型臨床癥狀有節(jié)段性肌陣攣、反射消失、張力減退、高血壓和心動(dòng)過速等。腦電圖檢查，有彌漫性慢波伴隨雙側(cè)尖波[19]。MRI掃描后可見急性期大腦皮層下和白質(zhì)廣泛局灶性損傷[20]。而孟加拉國(guó)和印度患者呼吸系統(tǒng)癥狀比例較高，占總病例數(shù)的50%～66%，馬來西亞患者中約占29%[5]。

4 病理變化

病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，NVD的病變主要發(fā)生在患者的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。其病理學(xué)基礎(chǔ)是病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致多器官血管炎。受感染血管的內(nèi)皮細(xì)胞逐漸融合成多核巨細(xì)胞，其他內(nèi)皮細(xì)胞則被溶解脫落進(jìn)入血管內(nèi)。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，形成血栓，堵塞毛細(xì)血管，導(dǎo)致臟器缺血。受影響的器官由于被堵塞而出現(xiàn)點(diǎn)狀皮下出血。血管炎會(huì)通過內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管壁的纖維化壞死、出血或血栓影響小動(dòng)脈、小葉和毛細(xì)血管的正常功能。在大腦、肺和腎小球等臟器血管的內(nèi)皮細(xì)胞中能看到巨細(xì)胞合胞體。病變血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的神經(jīng)元也出現(xiàn)退行性病變、胞質(zhì)嗜酸性和核內(nèi)包涵體。免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色顯示病變內(nèi)皮細(xì)胞周圍的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和肺泡里也有NiV[1]。

NVD導(dǎo)致一系列臨床癥狀和病理變化，與NiV進(jìn)入細(xì)胞的方式和逃避機(jī)體免疫防御系統(tǒng)有關(guān)。NiV進(jìn)入細(xì)胞包括吸附和膜融合2個(gè)主要過程，首先參與吸附的糖蛋白NiV-G結(jié)合到細(xì)胞表面受體肝配蛋白 B2/B3上，觸發(fā)F（融合）蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，發(fā)揮膜融合功能，從而使NiV核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)Liu等[21]研究表明，NiV-G觸發(fā)膜融合的機(jī)制主要分3步，即受體介導(dǎo)的NiV-G糖蛋白按時(shí)空性依次發(fā)生構(gòu)象變化，其中2個(gè)構(gòu)象變化在NiV-G蛋白頭部，1個(gè)在NiV-G頸部。實(shí)驗(yàn)表明，無頭部突變株也能激發(fā)NiV-F發(fā)生膜融合，2個(gè)頭部的構(gòu)象改變可暴露頸部特異性結(jié)構(gòu)域。而且，NiV-G頭部只有與特異受體結(jié)合后，才會(huì)觸發(fā)膜融合，正常情況下NiV-G頭部通過隱藏頸部結(jié)構(gòu)域避免過早觸發(fā)NiV-F的膜融合。

病毒能在宿主細(xì)胞成功復(fù)制，一般均有相應(yīng)的逃避宿主免疫系統(tǒng)的策略。已證實(shí)NiV的P蛋白（NiV-P）、V蛋白（NiV-V）和W蛋白（NiV-W）能阻斷I型IFN信號(hào)傳導(dǎo)并結(jié)合信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1,STAT1）蛋白。NiV-W蛋白通過阻礙核內(nèi)STAT1，阻斷Toll樣受體3依賴的IFN刺激基因誘導(dǎo)、TANK結(jié)合激酶1/NF-κB抑制因子ε介導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子3活化來抑制宿主IFN應(yīng)答。突變NiV-P及其基因表達(dá)產(chǎn)物不能去除病毒對(duì)IFN的抑制作用，說明還有其他蛋白或通路在調(diào)控。Bharaj等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NiV基質(zhì)蛋白M通過結(jié)合E3-泛素連接酶TRIM6，能抑制NF-κB抑制因子ε介導(dǎo)的I型IFN抗病毒作用，從而導(dǎo)致病毒增殖傳播。

5 實(shí)驗(yàn)室診斷

因NiV屬于生物安全4級(jí)病毒，相關(guān)病原操作均要在相應(yīng)安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行或者對(duì)病原滅活后再進(jìn)行操作。有多種診斷NiV感染的方法，包括RT-PCR法、ELISA法、中和試驗(yàn)、免疫組化、分離病毒法及電鏡觀察法等。RT-PCR法檢測(cè)快速，可以根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心中公布的NiV全基因組序列，選擇NiV高度保守的N基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。

ELISA法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，也常用于檢測(cè)血清或腦脊液中的抗體。Danids等[23]2000年用捕獲ELISA法檢測(cè)患者腦脊液中的IgM抗體為陽性。CDC也用ELISA法和捕獲ELISA法檢測(cè)IgG和IgM，并成為馬來西亞NiV檢測(cè)的有效方法。中和試驗(yàn)是公認(rèn)的檢測(cè)方法，可在RT-PCR和ELISA法篩查為陽性時(shí)，用血清中和試驗(yàn)做進(jìn)一步確診。

病毒分離和電鏡觀察是最直觀的檢測(cè)方法。Chua等[19]1999年將2例疑似感染患者腦脊液接種Vero細(xì)胞，5 d后細(xì)胞出現(xiàn)合胞體現(xiàn)象，分離出NiV。之后又對(duì)NiV進(jìn)行了一系列觀察鑒定，電鏡負(fù)染法觀察NiV核衣殼形態(tài)呈絲狀“鯡魚骨”形（圖3A），有NiV從細(xì)胞膜上出芽（圖3B），細(xì)胞外完整病毒粒子多形性，直徑約500 nm（圖3C）。采集人腦組織進(jìn)行免疫組化觀察鑒定，并對(duì)NiV進(jìn)行了基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析[1]。

圖3 NiV細(xì)胞分離株電鏡負(fù)染超微結(jié)構(gòu)圖[1]A.NiV核衣殼（鯡魚骨形）；B.NiV出芽；C.細(xì)胞外病毒形態(tài)；標(biāo)尺.100 nmFigure 3 Ultrastructural structure of Nipah virus isolated strain in cell culture by negative stain electron microscope[1]

6 防 治

NVD作為危害人類和動(dòng)物健康的烈性傳染病，目前還沒有可供使用的特效藥。特異性抗體實(shí)驗(yàn)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中效果良好，但還未上市。以多種病毒為載體構(gòu)建的重組NiV疫苗也在試驗(yàn)中，除針對(duì)馬HeV的亞單位疫苗上市外，其他均無上市疫苗[24]。

小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)抗體療法效果不錯(cuò)，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)均在動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀前就給予抗體治療，不能反映出現(xiàn)臨床癥狀后給予抗體療法的效果。Geisbert等[25]評(píng)估了人源單克隆抗體m102.4的治療效果。將16只非洲綠猴隨機(jī)分成4組，每組4只，第4組為對(duì)照組。對(duì)這16只非洲綠猴全部氣管內(nèi)攻致死劑量的NiV-MY株，然后前3組分2次注射m102.4抗體治療（15 mg/kg），第1組在攻毒后的第1 d和第3 d，第2組在攻毒后的第3 d和第5 d，第3組在攻毒后的第5 d和第7 d分別注射抗體治療，第4組作為對(duì)照不注射抗體。8～10 d后，未注射抗體的猴均發(fā)病，注射了抗體的12只猴均存活。第5 d才首次注射抗體的第3組非洲綠猴雖然發(fā)病，但在第16 d均恢復(fù)了健康。結(jié)果表明m102.4抗體療法在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)具有良好的治療效果，具備用于人NiV感染治療的潛力。該研究顯示抗體對(duì)NiV-MY株有明顯療效，但是否能夠成功控制強(qiáng)毒NiV-BD株還不清楚，須要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

許多在研疫苗在小動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型上的實(shí)驗(yàn)表明，可完全預(yù)防NiV感染。這些候選疫苗利用痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、麻疹病毒及水皰性口炎病毒作為載體，將NiV-G基因插入其中，獲得的重組毒免疫倉鼠、豬、水貂等動(dòng)物，然后攻毒保護(hù)，獲得了較理想的保護(hù)效果。其中用水皰性口炎病毒做載體構(gòu)建的重組疫苗效果更為明顯，目前已證明能給倉鼠、水貂及非洲綠猴提供保護(hù)[26-29]。

上市的馬用亞單位疫苗Equivac? HeV具有交叉保護(hù)非洲綠猴免受NiV感染的能力。用可溶性HeV G蛋白亞單位加氫氧化鋁膠佐劑（Alhydrogel?）和CpG寡聚脫氧核苷酸2006（CpG ODN 2006，即含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸）佐劑作為疫苗，0 d和21 d分別通過肌肉注射免疫非洲綠猴，然后氣管內(nèi)接105TCID50（50%組織細(xì)胞感染量）NiV，10 d后結(jié)果顯示，免疫組獲得了完全保護(hù)。免疫組非洲綠猴沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，未檢測(cè)到病毒核酸；對(duì)照組則表現(xiàn)出食欲減退，行為異常，呼吸窘迫等一系列臨床癥狀[30]。實(shí)驗(yàn)表明HeV G亞單位疫苗具有良好的交叉保護(hù)作用。遇到緊急情況時(shí)，可以考慮用該亞單位疫苗防控NVD。另外，制定免疫計(jì)劃首先應(yīng)當(dāng)把家畜列入其中，比如NVD疫情流行地區(qū)的豬、馬等[5]，攜帶病毒的動(dòng)物減少了，人類才能更安全。以HeV G蛋白制備的亞單位疫苗Equivac? HeV已于2012年12月在澳大利亞上市，用于防控馬匹HeV感染，目前已用于12萬匹馬的免疫，效果良好。目前構(gòu)建的候選疫苗主要是DNA疫苗、重組活載體疫苗，實(shí)驗(yàn)顯示具有良好的保護(hù)力。這些候選疫苗以特異性體液免疫為主，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異抗體，而非特異性先天免疫可能存在不足。上述候選疫苗和七肽重復(fù)區(qū)（heptad repeat region, HR）衍生多肽聯(lián)合使用，或許可以增強(qiáng)疫苗的非特異免疫效果。NiV-F蛋白裂解后活化的F1蛋白通過2個(gè)七肽重復(fù)區(qū)HR1/HR2組成六螺旋束狀結(jié)構(gòu)（six-helix bundle, 6HB），參與膜融合。HR衍生多肽是HR1/2類似物，可以干擾6HB的形成，從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。

鑒于可靠療法還未出現(xiàn)，物理化學(xué)預(yù)防仍是控制該病的有效手段。在NVD威脅地區(qū)工作的人員，建議做好個(gè)人防護(hù)，如戴口罩、護(hù)目鏡、手套，穿長(zhǎng)袖工作服和長(zhǎng)筒靴，勤洗手，常對(duì)工作物品進(jìn)行消毒。在養(yǎng)殖場(chǎng)工作的人員，應(yīng)避免動(dòng)物采食被果蝠咬過的水果，并合理控制養(yǎng)殖密度。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)遠(yuǎn)離易吸引蝙蝠的果園。疫區(qū)居民勿飲用被污染的椰棗汁，或收集椰棗汁時(shí)在周圍加蓋遮擋物，防止椰棗汁被蝙蝠分泌物、糞便污染[31]。

我國(guó)雖然還沒有NVD疫情暴發(fā)，但新疆、云南、西藏毗鄰印度，鄰近孟加拉國(guó)，具有被傳入的風(fēng)險(xiǎn)。另外隨著與世界各國(guó)往來交流日益頻繁，也增加了NVD傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。因此隨時(shí)關(guān)注該病的流行發(fā)展動(dòng)態(tài)，提前著手準(zhǔn)備，研制高效的疫苗和特異藥物，對(duì)防控NVD傳入我國(guó)，保障人們健康、維持經(jīng)濟(jì)繁榮等具有重要意義。