兩株草莓灰霉菌拮抗菌的鑒定及抑菌作用研究

趙慧軍 康雅娟 李建鵬 李志忠

1. 蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅、蘭州，730000；2.蘭州理工大學(xué)，甘肅、蘭州，730000

引言

灰霉病是由半知菌亞門(mén)、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害[1]，其分生孢子萌發(fā)侵染性強(qiáng)、可感染多種果蔬，引起植株枯萎、根部及果實(shí)腐爛、莖稈壞疽[2]，不僅嚴(yán)重危害果蔬的生長(zhǎng)，也影響果蔬運(yùn)輸過(guò)程中的防腐保鮮。當(dāng)前灰霉病的防治主要采用化學(xué)防治為主，配合農(nóng)業(yè)防治措施，輔以使用微生物菌劑，但不可避免的環(huán)境污染、健康問(wèn)題及作物病蟲(chóng)害抗性等日益嚴(yán)重[3]。

隨著灰霉病生物防治 的廣泛深入研究，植物病害生物防治的優(yōu)勢(shì)凸顯，尤其是其生態(tài)效益和安全性。研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉孢子懸液、羅倫隱球酵母細(xì)胞、放射腐霉、地衣芽孢桿菌、熒光假單胞菌等生防菌都能有效的抑制草莓灰霉菌的生長(zhǎng)及侵染[4]。芽孢桿菌由于其對(duì)熱、紫外線(xiàn)、輻射和化學(xué)藥劑的強(qiáng)耐受性和抗性[5]，及其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用引起關(guān)注，研究表明，芽孢桿菌作為植物體內(nèi)常見(jiàn)內(nèi)生細(xì)菌，其抗菌物質(zhì)可拮抗多種植物病原菌。植物病原菌在不同的地域及生長(zhǎng)環(huán)境中表現(xiàn)出不同的致病性及遺傳學(xué)，因此，從靶向區(qū)域作物根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)中篩選優(yōu)勢(shì)拮抗菌，更能實(shí)現(xiàn)生物防治的靶向性及長(zhǎng)效性[5]。

甘肅省蘭州市紅古區(qū)作為綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化示范區(qū)，土壤氣候條件適合多品種草莓種植。本實(shí)驗(yàn)通對(duì)紅古區(qū)花莊鎮(zhèn)草莓標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地的調(diào)查采樣，從感染灰霉病的草莓果實(shí)、根際土壤中分離得到芽孢桿菌26株，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)篩出對(duì)草莓灰霉菌具有較強(qiáng)抑菌和拮抗作用的芽孢桿菌，并進(jìn)行菌種誘變得到2株具有穩(wěn)定抗病能力的菌株，通過(guò)生物學(xué)特征檢測(cè)和分子鑒定，為后續(xù)草莓灰霉病的生物防治提供了研究基礎(chǔ)[5]。

1. 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中植物病原菌草莓灰葡萄孢菌（Botrytis sp. isolate NO_9）由課題組從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)灰霉病高發(fā)區(qū)病果中分離鑒定保藏。拮抗菌HZ12和 HZ02從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)病果根際土壤分離純化保藏。

1.2 試劑

牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基；牛肉膏液體培養(yǎng)基；馬鈴薯培養(yǎng)基；DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；DNA 電泳上樣緩沖液（日本TaKaRa 公司）；Taq 酶（日本TaKaRa 公司）；100 DNA Ladder Marker（北京艾德萊生物科技有限公司，DM1001）；瓊脂糖（西班牙Biowest 公司）；DNA 膠純化試劑盒（購(gòu)自AXYGEN 公司）；引物（invitrogen）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗菌的形態(tài)觀(guān)察

將拮抗菌接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基，35℃，160r/min發(fā)酵培養(yǎng)12h,用無(wú)菌水制備菌懸液，稀釋后涂布平板，35℃培養(yǎng)12h,觀(guān)察單菌落形態(tài)。

1.3.2 拮抗菌的生理生化檢測(cè)

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]和《微生物鑒定手冊(cè)》[9]對(duì)拮抗菌進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 拮抗菌分子鑒定

拮抗菌的DNA提取使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，PCR擴(kuò)增16srDNA,采用25μl擴(kuò)增體系（見(jiàn)表1-2）?；厥諗U(kuò)增片段，委托南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

表1 PCR 反應(yīng)體系的組成

表2 PCR 反應(yīng)程序

1.3.4 拮抗細(xì)菌對(duì)草莓灰霉菌抑菌作用研究

1.3.4.1 拮抗菌對(duì)草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

將拮抗菌置于液體培養(yǎng)基中，37℃搖床160r/min震蕩培養(yǎng)24h。發(fā)酵液12000r/min離心10min，上清液用0.22μm細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾制備無(wú)菌濾液；分離得到的菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次制成菌懸液備用。挑取培養(yǎng)5d的灰霉菌絲接種到PDA平板培養(yǎng)基中心，25℃恒溫培養(yǎng)12h后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[10-11]。

采用杯碟法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定：PDA平板培養(yǎng)基放置3個(gè)牛津杯，分別加入100μl拮抗菌發(fā)酵液、拮抗菌發(fā)酵無(wú)菌濾液、拮抗菌菌懸液。25℃恒溫培養(yǎng)48h后側(cè)抑菌圈[12-13]。

1.3.4.2 拮抗菌對(duì)草莓灰霉病菌絲的破壞作用

對(duì)灰葡萄孢菌正常生長(zhǎng)菌絲和對(duì)峙生長(zhǎng)邊緣菌絲制備樣品[14］，掃描電鏡觀(guān)察。

1.3.4.3 拮抗菌對(duì)草莓灰葡萄孢菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

將培養(yǎng)5d的灰霉平板用0.3%吐溫80洗脫收集孢子，配置濃度為1.0×106個(gè)/ mL的孢子懸液，各取200μl孢子菌懸液和800μL細(xì)菌發(fā)酵濾液液加入EP管中充分震蕩，對(duì)照組取200μl孢子菌懸液和800μL無(wú)菌水；分別25℃恒溫培養(yǎng)24h后觀(guān)察孢子萌發(fā)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率[15]。

2. 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的形態(tài)特征

菌株HZ12單菌落圓形，白色不透明（圖1），菌落干燥，邊緣光滑，中間稍隆起，表面有褶皺（圖5-6）；油鏡鏡檢，革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀，形成橢圓形中生芽孢[10]（如圖3）。菌株HZ02單菌落白色不透明（圖2），成片菌落呈黏稠狀，表層光滑濕潤(rùn)，中間稍隆起，邊緣不規(guī)則（圖7-8）；菌體均為橢圓形、短桿狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，形成內(nèi)生芽孢（如圖4）。

圖1 HZ12菌落

圖2 HZ02菌落

圖3 HZ12菌體掃描電鏡

圖4 HZ02菌體掃描電鏡

圖5 HZ12單菌落

圖6 HZ12單菌落

圖7 HZ02單菌落

圖8 HZ02單菌落

2.2 拮抗菌的生理生化特征測(cè)定結(jié)果

如下表結(jié)果所示，菌株HZ12和HZ01均為好氧菌，均能耐受10%NaCl，接觸酶、淀粉水解、明膠水解、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性；葡糖糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、半乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，果糖、乳糖、棉子糖不產(chǎn)酸。

表3拮抗菌生理生化特征測(cè)定結(jié)果

2.3 拮抗菌16rS序列分析

菌株HZ12、HZ02的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)條帶1-2號(hào)（如圖7），經(jīng)測(cè)序，菌株HZ12、HZ02的序列分長(zhǎng)度分別為1454bp、1445bp。將16s rDNA序列與Genbank中的相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比較，并采用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，菌株HZ12與 Bacillus subtilis subsp. subtilis strain DSM 10（KJ812207.1 ）序列相似度達(dá)到 99%(如圖8);菌株HZ02與Bacillus amyloliquefaciens strain(KU879248.1 )相似性最高，序列相似度達(dá)到 100%（如圖9）。

圖8：菌株HZ1216S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖9：菌株HZ0216S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 拮抗細(xì)菌對(duì)草莓灰霉菌的抑制作用

2.4.1 拮抗菌對(duì)草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

采用杯碟法檢測(cè)拮抗菌株對(duì)草莓灰葡萄孢菌的抑制作用，圖10顯示，以無(wú)菌水為對(duì)照，菌株HZ12和HZ02具有較強(qiáng)的抑菌作用；發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)3d 后，抑菌圈直徑均在10-25 mm，抑菌效果較為穩(wěn)定（圖11-12）。如圖13-14所示，抗菌發(fā)酵液、拮抗菌發(fā)酵無(wú)菌濾液、拮抗菌菌懸液對(duì)灰霉菌均有抑制作用，發(fā)酵液與菌懸液的抑制效果最好，發(fā)酵無(wú)菌濾液的抑制效果較弱。說(shuō)明拮抗菌對(duì)灰霉菌的抑制作用主要來(lái)源于菌體。

圖10拮抗菌對(duì)照實(shí)驗(yàn)

圖11 HZ12菌株

圖12 HZ02菌株

圖13 菌株HZ12拮抗實(shí)驗(yàn)：A發(fā)酵液 B菌懸液C無(wú)菌濾液

圖14菌株HZ02拮抗實(shí)驗(yàn)：A發(fā)酵液 B菌懸液C無(wú)菌濾液

表4 拮抗菌對(duì)灰霉菌的抑制作用

2.4.2 拮抗菌對(duì)草莓灰葡萄孢菌菌絲的抑菌作用

抑菌圈邊緣菌絲表現(xiàn)出一定的畸形：菌絲變粗，扁平出現(xiàn)褶皺，菌絲斷裂。正常培養(yǎng)的菌絲光滑、細(xì)長(zhǎng)均勻。可見(jiàn)菌株HZ12和HZ02可抑制灰霉菌絲的生長(zhǎng)。

圖15正常生長(zhǎng)菌絲

圖16 菌株HZ12擴(kuò)散培養(yǎng)邊緣菌絲

圖17 菌株HZ02擴(kuò)散培養(yǎng)邊緣菌絲

2.4.3 拮抗菌對(duì)草莓灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

如圖18-20所示，添加了拮抗菌發(fā)酵濾液的灰霉孢子萌發(fā)率低，菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)畸形：多核，細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)凝聚、空洞，菌絲粗短等?；颐规咦釉?%的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,萌發(fā)率穩(wěn)定的保持在90%以上，平均達(dá)到94.72；添加拮抗菌發(fā)酵上清液的孢子懸液中，菌株HZ12處理的萌發(fā)率不超過(guò)14%，菌株HZ02處理的萌發(fā)率不超過(guò)18%；兩株拮抗菌對(duì)灰霉孢子的萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。

圖18 PDB孢子萌發(fā)液

圖 19 添加HZ12發(fā)酵液的孢子萌發(fā)液

圖20 添加HZ02發(fā)酵液的孢子萌發(fā)液

表5拮抗菌對(duì)灰霉孢子的萌發(fā)抑制作用

3. 結(jié)論與討論

綜上所述，從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)病果根際土壤篩選到的兩株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生物學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)同源性比較，菌株HZ12鑒定為枯草芽孢桿菌，菌株HZ02 為解淀粉芽孢桿菌。菌株HZ12、HZ02 對(duì)灰霉均有較好的抑制作用，可致使菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)多核、空洞，菌絲粗短，生長(zhǎng)緩慢；灰葡萄孢子萌發(fā)率從＞90%降低到＜18%，很大程度上減少了灰霉菌的感染率。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的抗病機(jī)制主要是與致病菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)、分泌脂肽類(lèi)化合物、有機(jī)酸、水解酶等抑菌物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等[16-21］。本研究將繼續(xù)對(duì)兩株拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化、抑菌活性物質(zhì)的分離純化，抑菌物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢菌的抑制作用機(jī)理和安全性能等方面進(jìn)一步深入研究。