實驗大鼠和小鼠多種細菌PCR檢測與分析

馮 潔，謝建云，魏曉鋒，馮麗萍，張 泉，高 誠*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009； 2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監(jiān)督檢驗站，上海 201203)

實驗動物微生物學質量是評價實驗動物質量的重要指標之一，定期對實驗動物進行微生物質量監(jiān)測是確保動物質量的重要手段。歐洲實驗動物聯(lián)合會(FELASA)定期發(fā)布和更新詳細全面的實驗動物健康監(jiān)控指南和人員培訓計劃，詳細闡述了監(jiān)測病原體的種類、采樣要求和檢測方法等[1]。國際知名的實驗動物企業(yè)(如CRL、Taconic)均制定一系列企業(yè)標準和檢測制度，對于病原體項目、動物年齡、檢測方法和頻率均有明確指示。我國于1994年頒布了國家標準《實驗動物微生物學等級及監(jiān)測標準》并陸續(xù)進行了修改和完善，按照微生物學和寄生蟲學規(guī)定了不同等級實驗動物應排除的病原體及對應的檢測方法。2017年以來中國實驗動物學會制定并發(fā)布兩批團體標準，新增了部分病原體項目及檢測方法，對于我國實驗動物質量保證和提升起到了促進作用。本研究在詳細比較國內外實驗動物細菌監(jiān)測方案并結合實際的基礎上，選取國外普遍要求檢測而我國國標暫未納入(螺桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌)以及國標規(guī)定檢測(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌)的細菌指標作為調查項目，采用PCR方法對2014年和2016年上海市實驗動物生產許可證單位實驗大鼠、小鼠的部分細菌攜帶狀況進行調查。調查結果可為上海乃至全國實驗動物微生物質量控制提供參考，也可為國家標準的修訂和完善提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本次調查的實驗動物包括小鼠和大鼠，來源于2014年和2016年上海市具有實驗大鼠、小鼠生產許可證的單位。清潔級和SPF級動物均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境。各年度檢測設施數(shù)量、動物數(shù)量及品系分布詳見表1和表2。

表1 不同年份實驗動物生產設施、動物數(shù)量統(tǒng)計表

表2 動物品系分布表

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶、2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)、DL2000 plus DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

無菌采集動物回盲部內容物，取0.2 g懸浮于1 mL的PBS(pH7.4)，850 r/min離心5 min后取上清液，按照細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行DNA模板抽提。獲得的DNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR引物序列

參照文獻[2-5]，根據(jù)GenBank登錄的牛棒狀桿菌16S rRNA序列(NR_118465.1)，利用Primer 5.0設計1對特異性引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表3。

表3 PCR引物列表

1.3.3 PCR反應程序

PCR反應體系50 μL，包括2× Taq Plus Master Mix(Dye Plus)25 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，DNA模板2 μL。

PCR反應程序：95°C預變性5 min后，按95°C 變性30 s，退火30 s，72°C 延伸30 s的程序循環(huán)34次，最后72°C 延伸10 min。

PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。將不同來源的陽性PCR產物進行歸類，隨機挑選陽性產物經(jīng)凝膠電泳純化回收后送至至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果與GenBank中已知核酸序列進行BLAST比對、驗證。

2 結果

2.1 設施分析

如圖1所示， 在SPF級設施未檢出金黃色葡萄球菌污染，清潔級設施2014年未檢出肺炎克雷伯桿菌污染，其它病原體在不同級別設施內均有不同程度的污染。所有清潔級設施均存在螺桿菌和牛棒狀桿菌污染，SPF級設施的螺桿菌和牛棒狀桿菌污染率分別為77.78%(2014年)、61.54%(2016年)和66.67%(2014年)、92.31%(2016年)。

圖1 不同細菌檢測項目的設施污染率比較

2.2 病原檢測結果分析

如圖2所示，大鼠螺桿菌陽性率為34.26%(2014年)和25.64%(2016年)，嚙齒檸檬酸桿菌陽性率為4.63%(2014年)和17.95%(2016年)，牛棒狀桿菌陽性率為23.15%(2014年)和33.33%(2016年)，金黃色葡萄球菌陽性率為5.56%(2014年)和7.69%(2016年)，綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌均未檢出陽性。小鼠螺桿菌陽性率為40.39%(2014年)和29.73%(2016年)，嚙齒檸檬酸桿菌陽性率為5.88%(2014年)和15.48%(2016年)，牛棒狀桿菌陽性率為19.22%(2014年)和38.33%(2016年)，金黃色葡萄球菌陽性率為1.57%(2014年)和0%(2016年)，綠膿桿菌陽性率為9.80%(2014年)和0.74%(2016年)，肺炎克雷伯桿菌陽性率(2014年0.78%，2016年3.69%)。

分別對不同級別動物不同年份的陽性率進行分析。如表4所示，螺桿菌僅清潔級大鼠陽性率呈上升趨勢，其他級別均下降。嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌在不同級別動物上的陽性率均呈上升趨勢。國標要求排除的3種細菌，金黃色葡萄球菌僅清潔級有陽性檢出，SPF級均為陰性，符合國標要求。大鼠綠膿桿菌無陽性檢出，不同年份、不同級別的小鼠均有陽性檢出，但均呈下降趨勢。大鼠肺炎克雷伯桿菌無陽性檢出，小鼠僅2014年清潔級為陰性，其他均有陽性檢出。

對陽性動物品系進行分析，螺桿菌陽性率相對較高的品系有BALB/c、ICR、KM等，僅KM陽性率升高，其它品系陽性率均下降。來自同一設施的22只清潔級F1小鼠螺桿菌全部為陽性。所有品系動物均檢出牛棒狀桿菌陽性。大多數(shù)品系的嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌陽性率均呈升高趨勢。金黃色葡萄球菌僅SD大鼠和BALB/c小鼠檢出陽性。綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌陽性樣品均集中在小鼠。在動物飼養(yǎng)管理和使用過程中應加以關注(表5,表6)。

圖2 PCR檢測不同動物陽性率統(tǒng)計

表4 PCR檢測不同級別動物陽性率統(tǒng)計(%)

表5 PCR檢測不同品系動物陽性率統(tǒng)計(%，2014年)

表6 PCR檢測不同品系動物陽性率統(tǒng)計(%，2016年)

3 討論

細菌病原學檢測方法可分為傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)以及PCR等分子生物學方法。當前國際先進標準已廣泛使用PCR方法對實驗動物病原體進行監(jiān)測，中國實驗動物學會制定的團體標準中亦發(fā)布了部分病原體(如螺桿菌、牛棒狀桿菌)的PCR檢測規(guī)程。但我國國標目前主要采用分離培養(yǎng)法進行檢測，尚未采用分子生物學方法。培養(yǎng)法需要培養(yǎng)基配制、采樣、分離培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定等多個環(huán)節(jié)，存在檢測周期長、操作流程繁瑣、檢測試劑的供應及標準化不足、對檢測人員的專業(yè)技術要求較高等諸多不足，嚴重制約了我國實驗動物質量標準以及檢測體系的完善與發(fā)展。PCR方法相較于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法特異性強，敏感性高。在規(guī)范試驗試劑、設備以及人員操作流程的前提下，可用于病原體的快速檢測，尤其適用于大規(guī)模篩查。

國外先進標準中普遍要求實驗大鼠、小鼠須排除的病原體，如螺桿菌、牛棒狀桿菌、檸檬酸桿菌等均未出現(xiàn)在我國標準中。螺桿菌主要以隱性感染形式存在于動物消化道，可致小鼠肝炎、肝細胞瘤、盲腸結腸炎、膽肝炎等多種疾病，嚴重影響實驗動物質量，已被公認為是嚙齒類實驗動物的重要致病菌。嚙齒檸檬酸桿菌為腸桿菌科檸檬酸桿菌屬成員之一，為條件性致病菌，可引起小鼠傳染性結腸增生、腹瀉、結腸炎甚至直腸脫垂等癥狀。對于免疫功能健全的成年小鼠，一般無明顯癥狀。牛棒狀桿菌可導致裸鼠表皮角化過度，俗稱“鱗皮病”。無毛鼠和免疫缺陷鼠一旦感染，幾乎終身攜帶。動物感染通常伴隨體重減輕、攝水量增加、結膜充血、異種移植物生長緩慢等現(xiàn)象，設施一旦污染很難清除[6]。金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌是我國實驗動物微生物學等級及監(jiān)測標準(14922.2-2011)中明確規(guī)定SPF級實驗大鼠、小鼠必須檢測和排除的病原菌[7]，均屬于條件性致病菌，正常存在于動物體內和環(huán)境中，當動物免疫功能低下時可感染動物。國外多數(shù)將其作為環(huán)境監(jiān)測的參考指標，當評估認為該病原體可能會對正在進行的實驗存在干擾時則要求監(jiān)測。

本研究參照文獻所述PCR檢測程序，對上海地區(qū)實驗鼠群進行大規(guī)模質量監(jiān)測，并從設施、動物級別、動物品系等多角度全面系統(tǒng)地分析了當前實驗大鼠、小鼠細菌的攜帶狀況。數(shù)據(jù)顯示，螺桿菌、嚙齒檸檬酸桿菌和牛棒狀桿菌在不同級別動物上均有陽性檢出。尤其是清潔級小鼠螺桿菌、所有級別動物的牛棒狀桿菌和檸檬酸桿菌污染率高、污染范圍廣，應引起重視。嚙齒檸檬酸桿菌、牛棒狀桿菌、肺炎克雷伯桿菌陽性率呈明顯上升趨勢，但螺桿菌、綠膿桿菌陽性率均呈下降趨勢。文獻數(shù)據(jù)顯示，螺桿菌呈全球性分布，Charles River對北美和歐洲實驗鼠群螺桿菌進行調查發(fā)現(xiàn)，螺桿菌是實驗鼠群主要流行的病原體。金黃色葡萄球菌是日本實驗大鼠和小鼠流行最普遍的病原體，小鼠設施陽性率達18.8%，大鼠設施陽性率達58.62%，歐美小鼠金黃色葡萄球菌的攜帶率為6%～11%，嚙齒檸檬酸桿菌感染率極低[8-10]。我國北京、廣東等地區(qū)也有螺桿菌、牛棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌陽性報道[11-14]。由此可見，國內外實驗鼠群病原體污染的流行趨勢基本一致。

雖然PCR方法具備精準、高效、便捷的優(yōu)勢，仍需結合經(jīng)典方法進行驗證。筆者認為后續(xù)應進一步溯源至陽性的設施和品系，開展細菌的分離培養(yǎng)及鑒定等病原學方面的工作，以全面細致了解本市實驗動物生產設施內上述細菌的分布情況。本研究的調查結果對于提高實驗動物質量和飼養(yǎng)管理水平起促進作用，為我國實驗動物國家標準的修訂和完善提供依據(jù)和參考。鑒于上述病原體對于動物本身及從業(yè)人員和環(huán)境的影響，生產單位作為國內實驗動物的源頭，應結合行業(yè)發(fā)展趨勢，加強飼養(yǎng)管理，制定并優(yōu)化監(jiān)測方案，從而提高動物品質和企業(yè)競爭力。