淫羊藿苷對(duì)SCID小鼠前列腺癌原位移植瘤雄激素受體信號(hào)通路的影響

陳德森，胡熙耀，陳少秀，吳勝英*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 十堰 442000； 2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)， 十堰 442000)

前列腺癌(prostatic cancer, CaP)指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，中老年男性是高危人群，在腫瘤發(fā)病率及死亡率中僅次于肺癌，占癌癥死亡的第二位，嚴(yán)重危害男性生命健康[1]。雄激素受體(androgen receptor，AR) 在雄性激素的代謝和發(fā)揮作用時(shí)起到重要作用，從生理角度來(lái)看，AR與雄性激素結(jié)合后可調(diào)控前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分泌，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中，AR發(fā)生磷酸化反應(yīng)是AR激活的重要途徑，因此，可以認(rèn)為AR過(guò)表達(dá)是促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN) 屬抑癌基因，PTEN基因缺失和AR過(guò)度表達(dá)都能引發(fā)前列腺癌的腫瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，且有研究表明，前列腺癌患者PTEN基因突變率顯著高于正常人[3-4]。目前，臨床上應(yīng)用最廣泛的前列腺腫瘤標(biāo)志物為前列腺癌特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)，是前列腺癌診斷、鑒別診斷及療效監(jiān)測(cè)的重要參考指標(biāo)[5]。在對(duì)前列腺癌原位移植瘤的研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷具有抑制前列腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)、遷移和侵襲的生物學(xué)活性[6-7]。但這一成果是針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)，而對(duì)在體動(dòng)物方面鮮有報(bào)導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)采用灌胃給藥的方法，研究淫羊藿苷對(duì)SCID小鼠前列腺癌原位移植瘤雄激素受體信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SCID小鼠 64只，5～6周齡，體質(zhì)量20.0～21.5 g，小鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院研究所提供[SCXK(鄂)2017-0031]，在十堰市太和醫(yī)院研究所清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)[SYXK(鄂)2017-0031]。福利倫理審查證號(hào)：湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)(福)第2018-1號(hào)。自然光照、恒溫20℃～22℃、恒濕60%～70%，自由飲用純凈水，喂養(yǎng)食料高壓滅菌處理。

1.2 主要試劑和儀器

淫羊藿苷(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：0170203)；乙醚(廣州錢盛化工有限公司，批號(hào)：20161124)；人 LNCaP前列腺癌細(xì)胞株(上海酶研生物科技有限公司，批號(hào)：0712633-012)；PTEN、AR 檢測(cè)用RT-PCR試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：0161024，0161029)；EDTA和RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，批號(hào)：)；胎牛血清(FBS)(賽默飛公司，批號(hào)：0161203)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 癌細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將在液氮罐中凍存的人 LNCaP前列腺癌細(xì)胞株取出，37℃速融，然后倒入RPMI-1640培養(yǎng)液中復(fù)蘇24 h(培養(yǎng)箱通5%CO2、37℃怛溫)，每天換RPMI-1640培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)3 d。再用EDTA消化(0.25%)后收集足夠的人LNCaP前列腺癌細(xì)胞株，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成每毫升2×107個(gè)人LNCaP前列腺癌細(xì)胞的懸液，放入冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動(dòng)物模型制備及成模標(biāo)準(zhǔn)

模型參考文獻(xiàn)方法[8]，采用乙醚吸入的方法麻醉小鼠，固定，于下腹部正中切開皮膚、分離腹膜，暴露膀胱，將小鼠膀胱向尾端翻轉(zhuǎn)，暴露生殖腺并用棉簽推向左右腹壁，找到膀胱頸處的左右 2 葉(葉狀肉紅色組織)前列腺腺體。將備用的人 LNCaP前列腺癌細(xì)胞株用微量注射器抽取50 μL注射于左右 2 葉前列腺腺體的背外側(cè)包膜內(nèi)(兩葉各25 μL)。注射后恢復(fù)臟器解剖位置，縫合創(chuàng)口，消毒，待小鼠清醒后放入隔離器內(nèi)觀察(單籠飼養(yǎng))。成模標(biāo)準(zhǔn)：本實(shí)驗(yàn)在開展前的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)人員采用以上方法，將10只小鼠前列腺注射人 LNCaP前列腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)全部小鼠的前列腺均有移植瘤生長(zhǎng)，并廣泛地浸潤(rùn)到膀胱、精囊等組織，形成固定的實(shí)質(zhì)性腫瘤包塊。其中100%(10/10)有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，80%出現(xiàn)(8/10)肺轉(zhuǎn)移，40%(4/10)出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，30%(3/10)出現(xiàn)脾轉(zhuǎn)移、20%(2/10)出現(xiàn)腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)相符。在正式實(shí)驗(yàn)中，處死的動(dòng)物均與上述預(yù)實(shí)驗(yàn)一致，全部建模的64只小鼠在摘取前列腺時(shí)均有本移植瘤生長(zhǎng)并有廣泛的轉(zhuǎn)移，成瘤率達(dá)100%。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

注射2周后將上述建模的64只小鼠編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)均分為模型組、實(shí)驗(yàn)A組、B組和C組。

1.3.4 治療方法

實(shí)驗(yàn)A組、B組和C組于建模2周后分別按10 mg/kg、40 mg/kg和80 mg/kg劑量灌胃給予淫羊藿苷，模型組給予生理鹽水對(duì)照。四組均于早晚各灌胃給予淫羊藿苷或生理鹽水各一次，連續(xù)治療 5周。

1.3.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

四組于治療前和治療結(jié)束時(shí)各取8只小鼠，脫臼法處死，摘取前列腺，剝離前列腺瘤體背外側(cè)葉包膜，吸干、稱重、編號(hào)，分別測(cè)量長(zhǎng)、短徑各3次，取3次的平均值為最終結(jié)果。腫瘤抑制率計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[9]：實(shí)驗(yàn)組腫瘤抑制率=(C-T)÷C×100%，其中T=實(shí)驗(yàn)組平均瘤重；C=模型組平均瘤重。細(xì)胞周期采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)。取瘤組織剪碎，加入裂解液中沖打混勻，待其充分裂解后提取總RNA。采用RT-PCR檢測(cè)雄激素受體和張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因表達(dá)，檢測(cè)時(shí)以β-ACTIN為內(nèi)參，采用Bio-Rad熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)并計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。采用Western blotting檢測(cè)前列腺癌特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)和磷酸化AR(p-AR)相對(duì)表達(dá)量(灰度值)，采用Quantity One軟件分析其灰度值[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后p-AR和PSA 相對(duì)表達(dá)量比較

模型組治療前后AR、p-AR組內(nèi)治療前后比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)A組組內(nèi)治療前后比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。而實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后p-AR和 PSA低表達(dá)，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P<0.05)。(圖1)

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.2 各組治療前后AR mRNA、PTEN mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

模型組治療前后AR mRNA高表達(dá)，PTEN mRNA低表達(dá)，組內(nèi)治療前后比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)A組組內(nèi)治療前后比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。而實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后PTEN mRNA高表達(dá)，AR mRNA低表達(dá)，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.3 淫羊藿苷對(duì)各組細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)顯示， 模型組G0/G1比值較高，而S期較低，且治療前組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，說(shuō)明LNCaP前列腺癌細(xì)胞在G0/G1和S無(wú)序增殖，造模成功。治療后，實(shí)驗(yàn)A組與模型組及組內(nèi)治療前比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后前列腺癌LNCaP細(xì)胞阻滯于S期，其G0/G1比值明顯降低，S期明顯提高，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P< 0.05)。(圖3)

注：與治療前比較，aP <0.05；與模型組比較，bP <0.05。

2.4 各組治療前后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

四組治療前均有腫瘤生長(zhǎng)，且治療前組間比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，說(shuō)明造模成功。模型組抑瘤率較低，瘤質(zhì)量和瘤體積組內(nèi)治療前后比較無(wú)顯著性(P> 0.05)。治療后，實(shí)驗(yàn)A組與模型組及組內(nèi)治療前比較無(wú)顯著性(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后瘤質(zhì)量和瘤體積降低，抑瘤率提高，與模型組和治療前比較差異有顯著性(P<0.05)。(表1)

表1 各組治療前后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

注：與治療前比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。Note. Compared with before treatment,aP<0.05; Compared with model group,bP<0.05.

3 討論

淫羊藿(Epimedium brevicornu，Maxim)屬小檗科淫羊藿屬植物，又稱仙靈脾。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)除濕、強(qiáng)健筋骨、補(bǔ)腎壯陽(yáng)之功效。主治遺精早泄、腎虛陽(yáng)痿、筋骨攣急、腎虛喘咳、腰膝酸軟、麻木拘攣、風(fēng)濕痹痛、四肢不仁、半身不遂、小淋瀝、喘咳及更年期高血壓等[11-12]。淫羊藿苷是從淫羊藿的全草中提取的黃酮類生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)及抑制破骨細(xì)胞活性等藥理作用[13-14]。在中藥治療前列腺癌方面的研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿素有雌激索樣恬性，可以抑制LNCaP細(xì)胞前列腺癌特異性抗原的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)LNCaP細(xì)胞AR降解而發(fā)揮抑癌作用[15-16]。

研究表明，細(xì)胞S期和G0/G1與腫瘤增殖密切相關(guān)， S期和G0/G1周期紊亂是導(dǎo)致細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和凋亡失控的主因，可導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制性分化、增殖、惡化和轉(zhuǎn)移[17]。由于惡性腫瘤生長(zhǎng)的最基本生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞失控性增殖(即細(xì)胞周期調(diào)控紊亂)，故在治療惡性腫瘤時(shí)應(yīng)將失控性增殖的腫瘤細(xì)胞阻滯在細(xì)胞S期和G0/G1、G2/M期[18]。AR為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，屬性激素受體，與雄激素結(jié)合后激活下游靶基因，保持前列腺干祖細(xì)胞的正常分化[19]。研究表明，大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展均存在組蛋白乙酰化現(xiàn)象，正常前列腺干祖細(xì)胞內(nèi)AR的低表達(dá)，而低表達(dá)的AR可維持干祖細(xì)胞的干細(xì)胞特性并抑制該細(xì)胞的分化，AR在組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Tip60)及雄激素的刺激可誘導(dǎo)其乙酰化而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)AR的核轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞增殖增強(qiáng)[20]。PTEN是繼p53后發(fā)現(xiàn)的較強(qiáng)的腫瘤抑制基因，具有磷酸化酶活性，與AR表達(dá)存在明顯的相關(guān)性，可通過(guò)阻止AR乙?；档虯R活性，從而發(fā)揮抑制列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移的作用[21]。

在本研究中，模型組治療前后AR、p-AR、AR mRNA均高表達(dá)，PTEN mRNA低表達(dá)，說(shuō)明采用人LNCaP前列腺癌細(xì)胞株懸液前列腺內(nèi)注射的方法建立前列腺癌原位移植瘤模型后，AR發(fā)生乙?；F(xiàn)象，低表達(dá)的PTEN mRNA不能阻止AR乙?；琇NCaP前列腺癌細(xì)胞在前列腺處于無(wú)序增殖。另外，模型組抑瘤率較低，瘤質(zhì)量和瘤體積組內(nèi)治療前后比較無(wú)顯著性。流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)顯示模型組G0/G1比值較高，而S期較低，且治療前組間比較無(wú)顯著性，說(shuō)明LNCaP前列腺癌細(xì)胞在G0/G1和S無(wú)序增殖，提示造模成功。而實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后抑瘤率達(dá)(42.53±5.72，44.81±4.76)%，兩組AR mRNA、p-AR和 PSA低表達(dá)，PTEN mRNA高表達(dá)，且G0/G1期細(xì)胞比例降低、S期細(xì)胞比值升高，腫瘤細(xì)胞增殖被阻滯于S期，與治療前和模型組比較，差異有顯著性。這一結(jié)果與前面的研究結(jié)果一致。筆者分析認(rèn)為，淫羊藿苷可能通過(guò)抑制AR乙酰化，提高PTEN合成而降低AR活性，從而發(fā)揮抑制列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移效應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后，p-AR和 PSA低表達(dá)，說(shuō)明治療有效。實(shí)驗(yàn)B組、C組治療后G0/G1期細(xì)胞比例降低、S期細(xì)胞比值升高，提示腫瘤細(xì)胞增殖可能被阻滯于S期。

綜上所述，淫羊藿苷可明顯抑制LNCaP前列腺癌原位移植瘤的生長(zhǎng)。眾所周知，前列腺癌具有雄性激素依賴性，而AR的乙酰化是可逆的過(guò)程，推測(cè)淫羊藿苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)雄激素受體信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)抑制，在這個(gè)過(guò)程中，淫羊藿苷首先逆轉(zhuǎn)AR乙酰化，使AR去乙?；⒔档推浠钚?，進(jìn)一步減少與雄性激素結(jié)合，降低前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)必需的激素基礎(chǔ)，同時(shí)提高抑癌基因PTEN，高水平的PTEN 可增強(qiáng)磷酸化酶活性而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淫羊藿苷可使失控性增殖的腫瘤細(xì)胞阻滯在S期，這為淫羊藿苷應(yīng)用于臨床治療前列腺癌提供了理論參考。