斑馬魚mcm5基因的表達(dá)分析及在體節(jié)發(fā)生中的功能

張 雨，吳永梅，劉 敏，黃四洲*

(1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610500； 2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室；四川省發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610500)

在胚胎發(fā)育中受精卵從單細(xì)胞到完整生命體，經(jīng)過了一個極其復(fù)雜而漫長的發(fā)育過程。在此過程中細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂的同時也在發(fā)生命運(yùn)決定，細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化各自相互獨(dú)立卻又互為偶聯(lián)[1]。Gem最早是在非洲爪蟾中被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞周期中DNA復(fù)制調(diào)控[2]，隨后被發(fā)現(xiàn)分別參與了神經(jīng)[3-4]、眼睛[5]、血液[6]、癌癥等發(fā)生的調(diào)控，并被證明在調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞分化中起到了不可取代的作用[1,7]，這充分表明細(xì)胞周期因子不僅參與了細(xì)胞周期的精細(xì)調(diào)控，同時也作為一重要調(diào)控因子參與了胚胎發(fā)育的細(xì)胞命運(yùn)決定過程。MCM5是DNA復(fù)制起始復(fù)合體中MCM2-7復(fù)合小體的重要因子，在幾乎所有真核生物細(xì)胞中都存在[8-9]，對DNA復(fù)制的起始和延伸起著重要的作用。MCM5在細(xì)胞中的數(shù)量極為豐富，其數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了任何情況下起始DNA復(fù)制所必須[10]，這便暗示了MCM5可能擁有Gem相似的功能，參與到了細(xì)胞命運(yùn)分化決定的過程中。部分報(bào)道表明MCM5參與了細(xì)胞命運(yùn)的決定和組織器官的發(fā)育[7,11-12]，但這些都與細(xì)胞周期的停止和細(xì)胞凋亡相關(guān)[11]，而鮮有MCM5作為調(diào)控因子直接參與了胚胎各組織器官發(fā)育的特異性調(diào)控。

近年來，MCM5在部分研究中已被證實(shí)參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，暗示MCM5可能會作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子直接參與胚胎各組織器官的發(fā)育調(diào)控。運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉實(shí)驗(yàn)分析復(fù)制起始位點(diǎn)與MCM5復(fù)合體數(shù)量關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)在復(fù)制起始位點(diǎn)以外的地方存在許多MCM5結(jié)合的染色質(zhì)位點(diǎn)[13]。這些位點(diǎn)可能與MCM5結(jié)合，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄。在果蠅S2細(xì)胞中將MCM5量降低95%后，正常生存環(huán)境下S2細(xì)胞DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程仍不受影響[14]，這更提示MCM5可能還參與到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中。另外，在大鼠成纖維細(xì)胞[15]及免疫細(xì)胞[16]中發(fā)現(xiàn)MCM5直接或間接參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控；在細(xì)胞缺氧情況下MCM5與其他MCM家族成員形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，直接與HIF1結(jié)合而抑制HIF1的轉(zhuǎn)錄活性[17]。以上信息表明MCM5的確參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時也暗示了在胚胎發(fā)育中MCM5可能通過特定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了組織器官的發(fā)育調(diào)控。MCM5少有被報(bào)道參與胚胎發(fā)育組織器官的發(fā)育調(diào)控，部分緣于在哺乳動物中重要細(xì)胞周期因子MCM5突變將導(dǎo)致胚胎在囊胚期死亡[18]。在斑馬魚中可以成功的將目的基因進(jìn)行敲降并在體外實(shí)時觀察胚胎發(fā)育的情況，這為本課題組研究MCM5在胚胎發(fā)育中的功能提供了便利。

體節(jié)是沿胚胎前后軸空間順序形成一定數(shù)目的重復(fù)性結(jié)構(gòu)，是軸旁中胚層(presomite mesoderm)細(xì)胞通過邊緣間充質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)化(MET)以后形成的細(xì)胞團(tuán)[19]，他們最后將形成骨骼、肌肉等組織。體節(jié)發(fā)生在不同模式動物中其分子調(diào)控機(jī)制存在一定的差異，但從形態(tài)發(fā)生上看，各個模式動物具有較高的共性。首先是軸旁中胚層的形成，然后沿體軸從前到后軸旁中胚層細(xì)胞以次周期性的形成體節(jié)，同時伴隨前后軸后端按照一定的速度向后生長延伸，以使新的PSM產(chǎn)生[19]。從機(jī)制上看分析，調(diào)控體節(jié)發(fā)生的細(xì)胞及分子調(diào)控機(jī)制在不同物種中存在高度的保守性：Notch及Wnt信號通路決定了體節(jié)發(fā)生的周期性及體節(jié)極性；而Fgf信號通路決定了體節(jié)發(fā)生的大小[20]。三者在胚胎發(fā)育早期共同調(diào)控了體節(jié)的正常發(fā)生。

本研究課題組運(yùn)用原位雜交及MO敲降技術(shù)，發(fā)現(xiàn)MCM5參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

野生型斑馬魚為AB品系。按照3R原則及動物喂養(yǎng)及使用倫理要求，斑馬魚在標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖條件下維持和喂養(yǎng)(28℃；pH=7.2)。

1.2 主要試劑

PCR purification Kit(D6492-01,Qiagen)；Reverse Transcription(#K1622,Thermo)；mMESSAGE mMACHINE(AM1340, Ambion)；Morpholino購自Gene Tools公司(mcm5MO：5-ATAGTTTCGATAAGT GCTGTCGATG-3；p53MO：5-GCGCCATTGCTTTGCAA GAATTG-3)；T4連接酶購自Invitrogen公司；Q5高保真酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；原位雜交相關(guān)的試劑主要購自Roche公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胚胎注射

mcm5MO細(xì)胞注射：將MO從-80℃冰箱拿出后室溫下融化，放入65℃恒溫加熱5 min讓沉淀溶解，離心。吸取上清MO將其稀釋成工作濃度(300 umol/L)，在胚胎1～4細(xì)胞時期進(jìn)行胚胎注射。

EGFPmRNA注射：將制備好的mRNA分裝，取出部分用RNase free水稀釋為30 ng/uL備用。胚胎在1～4細(xì)胞期注射注射卵黃。

1.3.2 整胚原位雜交

胚胎成長至所需時期，4%PFA固定24 h后剝膜過度到無水甲醇中脫水，于-20℃保存待用。原位雜交按照已報(bào)道方法進(jìn)行[7]。

注：A-C：在10hpf(hours post fertilization)前mcm5廣泛表達(dá)于胚胎中所有細(xì)胞；D-F：在體節(jié)發(fā)生期，mcm5在頭部、尾牙、新生體節(jié)等處高表達(dá)；G：在第4天部分表達(dá)也與胸腺細(xì)胞特異重合(箭頭)。

1.3.3EGFPmRNA的合成及原位雜交RNA探針的合成

限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒DNA線性化，酶切過夜，用DNA快速純化回收試劑盒回收線性化DNA模板，用mMessagemMachine試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA；然后利用酚氯仿抽提回收mRNA，異丙醇沉淀。測定mRNA的濃度，分裝并放置于-80℃保存待用。

使用DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的原位雜交RNA探針，然后通過RNA純化試劑盒純化回收，檢測濃度并-20℃保存待用。

2 結(jié)果

2.1 mcm5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達(dá)模式

在研究mcm5在胚胎發(fā)育中的具體作用前，首先運(yùn)用原位雜交方法檢測其在早期胚胎中的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)mcm5是母源性表達(dá)因子，在胚胎發(fā)育2細(xì)胞及128細(xì)胞時呈高表達(dá)(圖1A，B)，在原腸運(yùn)動及以前在胚胎中呈廣泛性表達(dá)(圖1A-C)。從體節(jié)發(fā)生早期開始表達(dá)出現(xiàn)特異性，從10體節(jié)開始mcm5在頭部、尾牙、側(cè)板中胚層及新生體節(jié)(箭頭)處等高表達(dá)(圖1D-F)。在第4天，mcm5被發(fā)現(xiàn)在胸腺等處集中表達(dá)(圖1G，箭頭所指)。以上數(shù)據(jù)表明mcm5在胚胎發(fā)育早期可能參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控。

注：A：圖中所示為mcm5 CDs區(qū)域5′ 端部分非翻譯序列及MO設(shè)計(jì)序列。B-C：mcm5MO功能驗(yàn)證。在EGFP序列上游添加一段與mcm5MO互為匹配的核酸序列，將整個序列克隆到pCS2+載體中(B)并制備EGFP mRNA。EGFP mRNA單獨(dú)注射EGFP. C：mRNA與mcm5MO共注射實(shí)驗(yàn)顯示mcm5MO能很好的抑制EGFP mRNA的翻譯。

2.2 mcm5 MO的設(shè)計(jì)及功能驗(yàn)證

為研究mcm5在斑馬魚胚胎發(fā)育中的作用，本課題組合成mcm5MO以特異的阻斷胚胎內(nèi)源性mcm5 mRNA的翻譯(圖2A)。同時為了研究mcm5MO是否工作，本課題組構(gòu)建了體外轉(zhuǎn)錄EGFPmRNA的載體(圖2B)。在該載體中于EGFP編碼區(qū)的上游添加了與mcm5MO完全匹配的DNA序列，這樣設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄所獲得的EGFPmRNA可以很好的與mcm5MO結(jié)合(圖2B)。理論上如果mcm5MO工作良好將會有效的抑制EGFP的翻譯，進(jìn)而間接表明mcm5MO在體內(nèi)能很好的抑制內(nèi)源性mcm5 mRNA的翻譯。結(jié)果表明，當(dāng)單獨(dú)注射EGFPmRNA時，在胚胎發(fā)育到第36小時仍然有較高量EGFP存在；而在共注射mcm5MO和EGFPmRNA的胚胎中，EGFP的量明顯降低(圖2C)。同時本課題組也發(fā)現(xiàn)，mcm5敲降的胚胎外觀上無明顯表型(圖2C)。以上實(shí)驗(yàn)間接表明體外合成的mcm5MO能較好的抑制內(nèi)源性mcm5mNA的翻譯。

注：A-C：mcm5調(diào)控了眼睛及體長的發(fā)育。與對照組相比，在注射mcm5MO后胚胎體軸變短(B)，眼睛變小(C，箭頭所示)。注射mcm5 mRNA回了mcm5MO注射所導(dǎo)致的表型(C)。D-E：mcm5MO注射并未導(dǎo)致心臟和血管發(fā)育的缺陷(紅色箭頭為血管；白色箭頭為心臟)。

注：A：與對照組胚胎相比，mcm5和p53功能敲降的胚胎體軸變短，眼睛變小。B-E：體節(jié)發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)變化。Notch信號通路配體deltaD表達(dá)降低(B)，振蕩基因deltaC和her1表達(dá)降低(C，D)，體節(jié)極性基因mespb從兩條變成一條(E)。

2.3 mcm5參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控

由于MCM5是DNA復(fù)制重要調(diào)控因子，MCM5功能敲降可能會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而影響MCM5功能敲降后表型的觀察。為研究MCM5功能敲降后胚胎特異性表型，本課題組在胚胎中共注射mcm5 MO及p53MO以敲降MCM5的功能，然后分析胚胎表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胚胎共注射p53MO及mcm5MO后后，胚胎體軸變短且眼睛變小(圖3AB)，但胚胎無明顯外觀上的差異(圖3A)。進(jìn)一步分析mcm5是否參與了心臟、血管等的發(fā)育調(diào)控。結(jié)果表明在mcm5功能敲降后心臟和血管的發(fā)育無明顯缺陷(圖3D-E)。為驗(yàn)證mcm5MO功能敲降的特異性，分析是否mcm5 mRNA可以回救mcm5 MO注射所導(dǎo)致的眼睛變小、體軸變短的外觀缺陷。結(jié)果顯示mcm5 mRNA能較好的回救mcm5 MO注射所致的胚胎變短、眼睛變小的表型(圖3C)，表明mcm5 MO的特異性作用。

由于mcm5 mRNA在體節(jié)發(fā)生時于軸旁中胚層及新生體節(jié)中高表達(dá)(圖1)，暗示mcm5可能參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控?；铙w胚觀察表明在mcm5功能敲降及對照組胚胎之間，體節(jié)形成無明顯的形態(tài)學(xué)差異(圖4A)。為進(jìn)一步研究mcm5是否參與了體節(jié)發(fā)生，在MCM5功能敲降的胚胎發(fā)育到10體節(jié)左右本課題組運(yùn)用原位雜交的方法分別檢查體節(jié)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)(圖3B-E)。與對照組相比，Notch 信號通路配體deltaD，deltaC表達(dá)明顯降低(圖4B-C)，并且在已經(jīng)形成的體節(jié)中，deltaC的表達(dá)也明顯降低(圖4C 虛線半括號所示)，表明MCM5可能通過Notch信號通路參與體節(jié)發(fā)生。為進(jìn)一步確認(rèn)mcm5在體節(jié)發(fā)生中的作用，在mcm5功能敲降后分析振蕩基因her1及體節(jié)極性基因mespb的表達(dá)。與對照組相比，雖然her1的表達(dá)降低，但其振蕩表達(dá)模式并沒受到影響(圖4D)；但極性基因mespb表達(dá)明顯降低，表達(dá)模式改變(圖4E)。以上數(shù)據(jù)表明MCM5功能降低導(dǎo)致了Notch信號活性降低及體節(jié)極性缺陷。

3 討論

MCM5是DNA復(fù)制所必須的細(xì)胞周期因子，除調(diào)控細(xì)胞周期外，MCM5被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，且被作為癌癥發(fā)生的標(biāo)記基因。但是MCM5在胚胎發(fā)育中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過研究mcm5在斑馬魚中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育早期mcm5于尾牙、軸旁中胚層及新生體節(jié)中表達(dá)，推測其可能參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在MCM5功能降低后雖然體節(jié)外觀上無明顯缺陷，但是體節(jié)標(biāo)記性基因deltaD等表達(dá)受阻，且體節(jié)極性基因mespb從野生型中的2條變?yōu)?條，表明MCM5參與了體節(jié)發(fā)生的調(diào)控。

Notch信號通路是體節(jié)發(fā)生的重要調(diào)控因子，眾多Notch信號通路分子突變直接導(dǎo)致了體節(jié)震蕩基因deltaC、her1等的震蕩表達(dá)模式紊亂，同時使得體節(jié)發(fā)生缺陷。在MCM5功能降低時，本課題組雖然發(fā)現(xiàn)Notch信號通路deltaD表達(dá)降低，但是并未發(fā)現(xiàn)震蕩基因的震蕩表達(dá)模式變化，這暗示在體節(jié)發(fā)生過程中，震蕩基因的震蕩表達(dá)模式不僅僅受Notch信號通路調(diào)控，同時也說明Notch信號通路活性要降低到一定程度才可使得震蕩基因的震蕩表達(dá)模式受損。雖然MCM5功能降低后震蕩基因震蕩表達(dá)模式?jīng)]受影響，但體節(jié)極性基因mespb表達(dá)模式變化，說明mcm5以一種較為復(fù)雜的方式調(diào)控了體節(jié)的發(fā)生。在體節(jié)發(fā)生中mcm5以何種方式調(diào)控了Notch信號通路活性及體節(jié)極性，有待進(jìn)一步研究。

本課題組以往研究表明在原腸運(yùn)動時mcm5調(diào)控了中內(nèi)胚層細(xì)胞間的剝離[7]，本研究又揭示了mcm5在體節(jié)發(fā)生中的作用，但mcm5在胚胎早期發(fā)生中的功能研究還遠(yuǎn)未結(jié)束。從前言分析中可知MCM5在細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于細(xì)胞周期中DNA復(fù)制所必須，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用也被證明。本研究原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示mcm5 mRNA在尾牙、頭部等其他組織也搞表達(dá)，進(jìn)一步說明mcm5可能還通過特定的方式參與了發(fā)育過程的其他活動。因此mcm5在體節(jié)發(fā)生及其他組織器官發(fā)育中的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。