茚三酮法測定茶葉游離氨基酸總量研究

涂云飛

摘要 鑒于茚三酮法測定游離氨基酸總量不夠穩(wěn)定，本文對(duì)茚三酮法測定茶游離氨基酸的顯色反應(yīng)時(shí)間與氨基酸濃度因素進(jìn)行了條件優(yōu)化，并考察了方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明，將200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液顯色體系均勻混合，沸煮結(jié)束后立即用自來水充分冷卻并加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值，所獲得的結(jié)果穩(wěn)定可靠，適宜作為茶葉中游離氨基酸總量的測定條件。

關(guān)鍵詞 茶葉；游離氨基酸總量；茚三酮

中圖分類號(hào) TS272.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）14-0235-01

Abstract In this paper，ninhydrin reaction parameters for determination of total free amino acid in tea samples were optimized.The results indicated that，the method was stable and reliable in the following cases：200 μL buffer（2×pH 5.6），200 μL water or tea extraction aqueous（tea to water was 1∶250，boiling 30 min），and 400 μL ninhydrin solution mixed sufficiently in one system，after boiling，the reaction system was cooled by tap water and then added 4.8 mL deionized water to colorimetric analysis at 570 nm，which was suitable to determine the total free amino acid in tea.

Key words tea；total free amino acid；ninhydrin

茶葉中的游離氨基酸除了含有組成蛋白質(zhì)常見的20種基酸外，還含有含量較為豐富的非蛋白質(zhì)組成成分的茶氨酸及γ-氨基丁酸。這些氨基酸不僅影響茶葉的口感風(fēng)味，而且還是對(duì)人體健康有益的重要因子。

茚三酮作為常見的試劑用于游離氨基酸總量的測定[1-5]，其原理是基于水合茚三酮首先與氨基酸反應(yīng)形成還原型茚三酮和氨氣，之后一分子水合茚三酮、一分子茚三酮和一分子氨氣縮合成Ruhemann紫（一種氨鹽）（圖1）。

鑒于現(xiàn)有茶葉中游離氨基酸總量采用茚三酮法的測定條件不夠穩(wěn)定[6-10]，同時(shí)考慮到國標(biāo)（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）的顯色體系操作步驟過于煩瑣。本文對(duì)試劑配制的簡化作了有益嘗試，并優(yōu)化了顯色反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

儀器設(shè)備：尤尼柯UV-2010紫外可見分光光度計(jì)。主要試劑：十二水合磷酸氫二鈉（AR級(jí)，純度≥99%，浙江湖州化學(xué)試劑廠）；一水合檸檬酸（AR級(jí)，純度≥99.5%，成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)）；茚三酮（AR級(jí)，純度≥95%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；谷氨酸[（HPLC級(jí)，純度≥98.5%，西格瑪奧德里奇（sigma-aldrich）上海貿(mào)易有限公司]；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制方法。①2×pH 5.6的緩沖液配制。將4.15 g十二水合磷酸氫二鈉和0.88 g一水合檸檬酸溶解于50 mL容量瓶中，并用去離子水定容至刻度，混合搖勻備用。②茚三酮溶液的配制。1×pH 5.6的緩沖液溶解茚三酮并定容至2%（w/v）（注：溶解時(shí)加入<10%體積分?jǐn)?shù)的乙醇助溶）。③谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取0.1 g谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻后備用。

1.2.2 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別準(zhǔn)確移取谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.6、3.2、6.4、12.8 mL至25 mL容量瓶中，并用去離子水定容至刻度，搖勻后備用。

10 mL具塞刻度玻璃試管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL稀釋后的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和400 μL茚三酮溶液，搖勻，沸煮結(jié)束后立即用自來水冷卻后加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值。

1.2.3 茶葉樣品測定體系。10 mL具塞刻度玻璃試管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液，搖勻，沸煮結(jié)束后立即用自來水冷卻后加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色

在試驗(yàn)條件摸索的過程中發(fā)現(xiàn)，體系中若只加水不加緩沖液，需在長時(shí)間加熱的條件下才能顯淺紫色，且易褪色；這可能是因?yàn)樵跓o緩沖體系的條件下，谷氨酸本身的pH值過低使反應(yīng)難以進(jìn)行。另外，若加pH 5.6的緩沖液反應(yīng)后不立即冷卻和用水稀釋，則高濃度的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（如512 mg/L）反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生沉淀，且反應(yīng)液變成黃紅色。同時(shí)，試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，在無氯化亞錫或其他還原劑存在的條件下，顯色反應(yīng)即可進(jìn)行，但保證氨基酸有效顯色的前提是反應(yīng)過程中需要沸煮和過量的茚三酮。

在穩(wěn)定反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體系在加熱5～30 min過程中均呈現(xiàn)出藍(lán)紫色，但512 mg/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色時(shí)沸煮10 min以上即有細(xì)粒漂浮沉淀產(chǎn)生，且吸光值超過0.8，即濃度過高的氨基酸會(huì)對(duì)測定體系產(chǎn)生影響。由表1可知，在選定的64～256 mg/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液范圍內(nèi)，沸煮10～30 min后吸光值隨濃度遞增呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，具體表現(xiàn)為：沸煮10 min的線性是Y=0.003 1X-0.003 5，R2=0.989 1；沸煮15 min的線性是Y=0.003X-0.071，R2=0.994；沸煮30 min的線性是Y=0.003X+0.002，R2=0.992。

2.2 方法的準(zhǔn)確性考察

進(jìn)一步對(duì)方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)溶液添加測定回收率試驗(yàn)。選擇本底茶樣提取液游離氨基酸總濃度為32.8 mg/L的茶樣添加50、100、200 mg/L的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，按上述方法測定的回收率，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，不同濃度的添加量，其回收率在70%～82%之間。

2.3 方法的精密度考察

稱取0.1 g的干綠茶和抹茶分別加入25 mL去離子水沸煮30 min，自然冷卻后用去離子水定至25 mL，離心取上清液，測定結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，抹茶和綠茶的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.3 mg/L和3.3 mg/L；變異系數(shù)分別為4.2%和5.3%，2組間測定結(jié)果差異不明顯，說明方法穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

茶游離氨基酸總量法測定所采用的顯色試劑為茚三酮，鑒于反應(yīng)中間產(chǎn)物在堿性條件下不穩(wěn)定[9]，國標(biāo)（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）規(guī)定，在用水配制該試劑過程中需加入氯化亞錫作為抗氧化穩(wěn)定劑，耗時(shí)較長，試劑需要提前1 d配制，且茚三酮在水中的溶解度較差，從而使顯色體系操作步驟過于煩瑣。本文在酸性緩沖體系（pH值5.6）中，對(duì)試劑配制作了簡化處理，并摸索了適合氨基酸顯色反應(yīng)的條件，即將200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液顯色體系均勻混合，并在一定時(shí)間沸煮結(jié)束后立即用自來水充分冷卻并加入去離子水充分混合測定，所獲得的結(jié)果穩(wěn)定可靠，適宜作為茶葉中游離氨基酸總量的測定條件。

4 參考文獻(xiàn)

[1] HARDING V J，WARNEFORD F H S.The ninhydrin reaction with amino-acids and ammonium salts[J].the Journal of Biological Chemistry，1916，25：319-335.

[2] WEST E S，RINEHART R E R.Reaction of ninhydrin with asorbic acid and other endiol conpounds：Decarboxylation of dehydroasorbic acid[J].the Journal of Biological Chemistry，1942，146：105-108.

[3] MOORE S，STEIN W H.Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids[J].the Journal of Biological Chemistry，1948，176：367-388.

[4] MOORE S，STEIN W H.A Modified ninhydrin Reagent for the photome-tric determination of amino acids and related compounds[J].the Journal of Biological Chemistry，1954，211：907-913.

[5] MOORE S.Amino acid analysis：aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the ninhydrin reaction[J].the Journal of Biological Chemistry，1968，243：6281-6283.

[6] 陳忠云.α-氨基酸和茚三酮反應(yīng)的顏色與條件[J].邵陽師專學(xué)報(bào)，1995（5）：56-59.

[7] 常秀蓮.pH值對(duì)茚三酮與谷氨酸顯色反應(yīng)的影響[J].發(fā)酵科技通迅，1999，28（4）：5.

[8] 張鍇棠，湯秀玉，韓紅.不同pH對(duì)氨基酸與茚三酮呈色反應(yīng)的影響[J].南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，11（2）： 126-128.

[9] 陳葆仁.茚三酮[J].化學(xué)通報(bào)，1961（6）：47-52.

[10] 阮伸.茚三酮比色測定氨基酸的改良[J].化學(xué)世界，1986（8）：357-360.