任 峰 李 健 賀國洋 賈昭華 千新來
(新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院,河南 新鄉(xiāng) 453003)
鐵是人體維持正常生理活動必不可少的微量元素,參與氧轉運、電子傳遞、DNA合成及許多酶促反應等生理過程。越來越多的證據(jù)顯示,機體鐵過載通過影響DNA合成與復制、基因轉錄后調控、細胞鐵攝取與外排等促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔1,2〕。膜鐵轉運蛋白(FPN)是細胞唯一的鐵輸出蛋白。Hepcidin是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)關鍵調節(jié)因子〔3,4〕,能夠結合、降解細胞膜上FPN,減少機體鐵的吸收和巨噬細胞鐵的釋放,增加循環(huán)可利用鐵〔5,6〕。研究表明,機體鐵病理性積累可能與腫瘤的發(fā)生、演進密切相關,去鐵治療已經(jīng)成為一種新的腫瘤治療方案〔7〕。當歸多糖(ASP)是傳統(tǒng)的補血、活血中藥。近年研究表明,ASP具有增強機體免疫力和抗腫瘤作用〔8~11〕。本研究探討ASP對Hepcidin的調節(jié)作用,以期為ASP抗腫瘤藥物開發(fā)和臨床治療提供新的依據(jù)。
1.1細胞 人正常肝細胞L-02和人肝癌細胞HepG2購自武漢大學細胞保藏中心,常規(guī)培養(yǎng)。
1.2試劑 當歸多糖(純度>98%,陜西慈緣生物技術有限公司,批號CY110320),無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司), RPMI1640培養(yǎng)基,(美國Invitrogen公司),青鏈霉素(美國Hyclone公司),RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs(日本TaKaRa公司),anti-Hepcidin,anti-β-actin抗體(英國abcam公司)。
1.3細胞總RNA提取、定量和RT-PCR 細胞處理:細胞接種于6孔板后培養(yǎng)12 h,觀察生長狀態(tài)。ASP最佳誘導濃度的確定,實驗分4組,分別用0、100、200、400 mg/L的ASP誘導HepG2和L-02細胞48 h,以0 mg/L的ASP為對照組。APS最佳誘導時間的確定,實驗分5組,用400 mg/L的ASP誘導HepG2和L-02細胞0、24、48、72 h和96 h,以ASP誘導0 h為對照組。按Trizol試劑說明書,提取細胞總RNA并定量。按照RT-PCR試劑盒進行逆轉錄反應,以合成的cDNA為模板采用RT-PCR方法檢測Hepcidin mRNA表達。Hepcidin引物序列:正義鏈5′-cctgaccagtggctctgttt-3′,反義鏈5′-cacatcccacactttgatcg-3′,擴增片段長度,183 bp;GAPDH引物序列;正義鏈5′-aatcccatcaccatcttcca-3′,反義鏈5′-cctgcttcaccaccttcttg-3′,擴增片段長度580 bp。PCR反應參數(shù):94℃預變性2 min,94℃ 1 min,51℃ 45 s,72℃ 1 min, 35個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色。以GAPDH為內參照。Bandleader 3.0圖像軟件分析結果。
1.4Hepcidin蛋白檢測 細胞處理:400 mg/L 的ASP誘導HepG2和L-02細胞96 h,以ASP未處理組為對照組。常規(guī)胰蛋白酶消化法收集對數(shù)生長期ASP處理后HepG2和L-02細胞總蛋白提取、定量及變性見參考文獻〔11〕,提取總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜后4°C封閉過夜,Ⅰ抗,Ⅱ抗孵育,檢測Hepcidin蛋白表達。Hepcidin多克隆抗體(兔抗小鼠,稀釋1∶100)、β-actin多克隆抗體(兔抗小鼠,稀釋1∶1 000)和辣根酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗(稀釋1∶5 000)。用Quantity one version 4.1.1軟件對Western印跡條帶進行采集和分析。
1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單向方差分析。
2.1ASP調控HepG2和L-02細胞Hepcidin mRNA表達 不同濃度ASP(0,100,200,400 mg/L)處理HepG2和L-02細胞48 h,RT-PCR方法檢測Hepcidin mRNA。結果顯示,ASP(200 mg/L,400 mg/L)可顯著下調HepG2和L-02細胞Hepcidin mRNA,且具有一定的劑量依賴性(P<0.01),見圖1,表1。后續(xù)實驗選用400 mg/L ASP進行研究。400 mg/L的ASP處理HepG2和L-02細胞,RT-PCR方法檢測不同時間點(24 h、48 h、72 h和96 h)Hepcidin的表達(圖2,表2),結果顯示;Hepcidin mRNA均顯著下調,且呈現(xiàn)時間依賴性(P<0.01)。后續(xù)實驗中對HepG2和L-02細胞,ASP誘導濃度和時間采用:400 mg/L,96 h。
M:DNA marker,1~4:0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L圖1 不同濃度ASP處理細胞48 h后Hepcidin mRNA表達RT-PCR擴增結果
表1 Hepcidin mRNA 水平表達變化RT-PCR檢測結果
M:DNA marker,1~5:0 h、24 h、48 h、72 h和96 h圖2 400 mg/L的ASP處理細胞不同時間點Hepcidin mRNA表達RT-PCR擴增結果
表2 Hepcidin mRNA 水平表達變化RT-PCR檢測結果
2.2ASP對HepG2和L-02細胞Hepcidin表達的影響 用400 mg/L的ASP誘導HepG2和L-02細胞96 h,Western印跡方法檢測Hepcidin的表達(圖3,表3),結果顯示:ASP可明顯下調HepG2和L-02細胞Hepcidin表達(P<0.01)。與對照組相比,抑制率分別為62%和74%。
1:HepG2細胞;2:ASP+HepG2細胞 3:L-02細胞; 4:ASP+L-02細胞圖3 ASP對HepG2細胞和L-02細胞Hepcidin表達的影響
表3 Hepcidin蛋白水平表達變化檢測結果
當歸為常用中藥材,具有補血、調經(jīng)、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力、預防和治療糖尿病等作用。ASP為當歸主要有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究證明ASP具有抗腫瘤作用〔8~10〕。鐵過載與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關〔12~15〕。研究表明,一是腫瘤細胞快速增殖需要大量的鐵,二是機體鐵過載導致細胞基因突變、氧化應激損傷、癌基因激活等,增強腫瘤細胞的增殖、遷移能力,促進腫瘤血管生成〔16〕。
Hepcidin是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的小分子多肽,其作用靶點FPN是哺乳動物細胞膜上唯一的鐵運出蛋白。Hepcidin能夠誘導FPN泛素使其降解,發(fā)揮調控腸道鐵的吸收和儲鐵細胞釋放鐵的作用,從而影響機體循環(huán)鐵水平〔9,10〕。研究發(fā)現(xiàn),正常人和腫瘤患者機體血清均有FPN和Hepcidin表達,但腫瘤患者Hepcidin表達顯著增加且FPN表達顯著減少〔17,18〕,提示Hepcidin表達增加可降解FPN,導致機體鐵沉積,增加腫瘤細胞生物可利用鐵〔19〕。
本研究表明,200和400 mg/L的ASP顯著下調人肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞L-02 Hepcidin基因水平,且呈劑量、時間相關;Western印跡證實ASP能夠在蛋白水平下調HepG2和L-02細胞Hepcidin表達。這與已報道的小分子質量ASP顯著抑制大鼠正常肝細胞Hepcidin表達結果一致〔20〕。
機體鐵超載是腫瘤發(fā)生的危險因素,目前尚未見通過藥物治療下調Hepcidin表達,降低機體鐵負荷,抑制腫瘤惡性表型的研究報道。本文證實ASP能夠在細胞水平抑制機體鐵代謝關鍵調控因子Hepcidin的表達,但能否在體內通過下調Hepcidin的表達,降低腫瘤患者機體鐵負荷還有待進一步研究。