依達(dá)拉奉聯(lián)合雷帕霉素對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬及學(xué)習(xí)記憶的影響

安朝旺 王 崢 李建民 趙雅寧 付愛(ài)軍 黃海玲

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000)

研究發(fā)現(xiàn)自噬參與蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)的早期腦損傷(EBI)病理進(jìn)程，決定EBI階段神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸：恢復(fù)或修復(fù)、加重或死亡〔1〕。雷帕霉素(RAP)是一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，可特異性抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞自噬進(jìn)程〔2〕。依達(dá)拉奉是2001年上市的氧自由基清除劑，被廣泛應(yīng)用于腦梗死、急性腦出血等疾病的救治〔3，4〕。目前有關(guān)RAP 和依達(dá)拉奉對(duì)SAH保護(hù)機(jī)制的研究不多。本研究建立SAH動(dòng)物模型，應(yīng)用依達(dá)拉奉聯(lián)合RAP進(jìn)行干預(yù)，觀察自噬關(guān)鍵因子Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1(輕鏈LC3)-Ⅱ表達(dá)及動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶恢復(fù)情況，分析RAP和依達(dá)拉奉對(duì)SAH神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組與模型制作 清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，體重350～450 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2009-003〕，分為假手術(shù)組、SAH組、RAP組和依達(dá)拉奉聯(lián)合RAP組(聯(lián)合組)。每組分為24 h、48 h、72 h 和144 h四個(gè)時(shí)間亞組。模型制作〔5〕采用經(jīng)典的二次注血法(向枕大池注射自體動(dòng)脈血0.3 ml，二次間隔時(shí)間為48 h)制備大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的模型。假手術(shù)組向枕大池兩次注入0.3 ml生理鹽水，余操作均與SAH組一致。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)進(jìn)行二次枕大池注血時(shí)，可見(jiàn)少量血性腦脊液在穿刺部位滲出；②剝離腦部時(shí)肉眼顯見(jiàn)血性液體散在分布在腦底基底池部位。RAP組：SAH模型制備成功后即刻經(jīng)腹腔注射100 μg/kg，每24 h給藥1次；聯(lián)合組在RAP組基礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈注射依達(dá)拉奉，10 mg/kg，每24 h給藥1次。

1.2動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶檢測(cè) 分別傷后第72小時(shí)和144小時(shí)采用Morris水迷宮進(jìn)行檢測(cè)，上午、下午各1次，記錄各組搜索安全島潛伏期時(shí)間和撤掉平臺(tái)后大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，取檢測(cè)記錄的總均值。

1.3腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 每組各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，常規(guī)麻醉后，處死動(dòng)物，用4%多聚甲醛灌注固定后，石蠟包埋、冠狀切片，HE染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。計(jì)數(shù)每個(gè)視野存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，具體方法：每只大鼠取4張海馬區(qū)切片，每張切片選取5個(gè)不重復(fù)的視野(共100個(gè)視野)，選Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng)分析，以每個(gè)視野下平均細(xì)胞百分率(400×)下CA1區(qū)存活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值表示。

1.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá) 腦組織標(biāo)本采集方法同HE染色，腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，37 ℃溫箱中孵育20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 次，每次5 min，用3%H2O2封閉15 min，PBS洗滌3×5 min，滴加兔抗鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶200，1∶200，1∶250)，4℃過(guò)夜；37℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌3×5 min，滴加二抗，37 ℃溫箱中孵育40 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染、脫水透明、封片。鏡下觀察并攝片。陽(yáng)性率的定量分析：每個(gè)標(biāo)本取4張切片，將每張切片的CA1區(qū)平均分為3個(gè)等份，每個(gè)等份選取一個(gè)相同部位的4個(gè)視野，應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行吸光度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析及SNK-q分析。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力 與假手術(shù)組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)明顯減少；與SAH組比較，RAP組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短、穿臺(tái)次數(shù)增多；與RAP組比較，聯(lián)合組逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短、穿臺(tái)次數(shù)明顯增多(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、排列整齊。SAH組海馬區(qū)可見(jiàn)較多壞死神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核溶解、核碎裂，或細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失；與假手術(shù)組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞存活率均明顯減少(P<0.05)。RAP組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，與SAH組比較，視野中存活神經(jīng)細(xì)胞明顯增多(P<0.05)；聯(lián)合組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步減輕，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元存活率均明顯增多(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.3各組海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核。假手術(shù)組海馬區(qū)有少量的陽(yáng)性細(xì)胞，染色較淡；與假手術(shù)組比較，SAH 組Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞染色棕黃，免疫陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與SAH組比較，RAP組Beclin-1和LC3-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞染色棕黃，免疫陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；聯(lián)合組神Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽(yáng)性反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4、圖2。

表1 各組逃避潛伏期和穿臺(tái)次數(shù)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與SAH比較：2)P<0.05；與RAP組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組大鼠72 h海馬區(qū)組織病理形態(tài)的變化(HE，×400)

表2 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活率比較

圖2 各組72 h海馬區(qū)Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)結(jié)果(DAB,×400)

表3 各組海馬區(qū)Beclin-1相對(duì)表達(dá)量比較

表4 各組海馬區(qū)LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)RAP可減少SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡，降低動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙，提示RAP對(duì)SAH的EBI有一定保護(hù)作用。RAP具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，臨床上主要用來(lái)協(xié)助器官移植術(shù)后的抗免疫治療〔6，7〕。近年研究顯示RAP具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可阻斷細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物1的活性導(dǎo)致ATP的損耗和細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成過(guò)多，拮抗神經(jīng)退行性病變?nèi)缗两鹕?、阿爾茨海默病進(jìn)程中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔8，9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAP可通過(guò)作用于其靶蛋白mTOR抑制其活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期、減少能量的耗損，降低促凋亡蛋白表達(dá)，以促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的存活〔10〕。RAP通過(guò)抑制mTOR激活，促進(jìn)自噬已被證實(shí)〔11〕。腦損傷狀態(tài)下，自噬激活能清除細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器、調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、減輕細(xì)胞損傷程度；但自噬過(guò)度可以促進(jìn)Caspase-3裂解，加重神經(jīng)細(xì)胞死亡〔12〕。本研究中RAP組自噬標(biāo)記蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)增加，此時(shí)神經(jīng)細(xì)胞存活率增加，動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶損傷情況，一方面說(shuō)明SAH的EBI階段自噬激活具有神經(jīng)保護(hù)作用，也說(shuō)明RAP通過(guò)增強(qiáng)EBI階段的自噬程度而發(fā)揮對(duì)SAH的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉對(duì)SAH有很好的保護(hù)作用。SAH后顱內(nèi)血液積聚、凝固血塊壓迫造成缺血缺氧、積聚的血紅細(xì)胞裂解使氧合血紅蛋白進(jìn)一步釋放超氧陰離子和生成羥基自由基，使氧自由基生成增加等，誘導(dǎo)強(qiáng)烈氧化應(yīng)激反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞損傷加重〔13，14〕。神經(jīng)保護(hù)劑依達(dá)拉奉主要通過(guò)清除氧自由基、減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)而防治腦損傷的持續(xù)進(jìn)展，這是本研究中聯(lián)合組中存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶情況均進(jìn)一步改善的主要原因。本研究中聯(lián)合組Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)增加進(jìn)一步增高，提示依達(dá)拉奉可強(qiáng)化RAP對(duì)SAH后自噬活性的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)氧自由基可激活自噬，且與mTOR途徑〔15〕；而依達(dá)拉奉可清除大量的氧自由基，使機(jī)體氧自由基水平保持在一定水平，從而維持SAH后自噬水平適度表達(dá)〔16〕。