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    Wnt7a及其受體Fzd5在大腸癌中的表達(dá)及意義

    2018-10-31 07:10:56王淑坤苗玉娟周風(fēng)華
    中國老年學(xué)雜志 2018年19期
    關(guān)鍵詞:信號

    孫 丹 王淑坤 苗玉娟 盧 強(qiáng) 侯 琛 宋 妍 周風(fēng)華

    (濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,山東 濰坊 261053)

    目前大腸癌的治療手段主要包括外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療及放射治療〔1,2〕,雖然治療手段不斷提高,但是由于治療后的高復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致大腸癌對人類健康仍然存在嚴(yán)重威脅〔3〕。Wnt基因編碼分泌型糖蛋白,主要通過與Frizzled(Fzd)受體結(jié)合參與細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤生長等多種生物學(xué)過程〔4〕。Wnt7a屬于Wnt家族中的經(jīng)典Wnt信號分子,通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號過程參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔5〕。本研究從受體與配體結(jié)合的角度,研究Wnt7a及受體Fzd5在大腸癌組織中的表達(dá)變化,探討Wnt7a及受體Fzd5在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

    1 材料和方法

    1.1材料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2015年1月至2016年12月結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本80例,男45例,女35例,年齡26~82(平均62)歲;以癌旁正常組織作為對照,切取石蠟切片用于HE染色及免疫組化染色。取10例新鮮腫瘤及瘤旁正常組織,放入液氮,用于提取RNA和蛋白,進(jìn)行qRT-PCR及Western印跡檢測?;颊咝g(shù)前均未接受化療及放療。

    1.2主要試劑 小鼠單克隆抗體Wnt7a購自Santa Cruz (sc-365459),兔多克隆抗體Fzd5購自Novus biologicals(IMG-71276)。二步法免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中山生物試劑有限公司。

    1.3免疫組化及判讀標(biāo)準(zhǔn) 主要步驟:切取石蠟切片,厚5 μm,常規(guī)脫蠟入水,過氧化氫(H2O2)封閉內(nèi)源性過氧化物酶,微波抗原修復(fù),滴加一抗(Wnt7a及Fzd5濃度均為1∶100),4℃過夜,二抗及DAB顯色,以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá),以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。判讀標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性著色比例和著色強(qiáng)度判定,陽性著色比例指陽性染色細(xì)胞占5個以上高倍鏡視野(400倍)同類細(xì)胞的百分比,陽性細(xì)胞<5% 為0分,≥5%且<25% 為1分,≥25%且<50%為2分,≥50%且<75%為3分,≥75%為4分;細(xì)胞著色強(qiáng)度計分:0分為細(xì)胞無著色,1分為淡黃色,2分為黃色、棕黃色,3分為棕褐色。將兩項得分結(jié)果相加:0~1分為陰性,2~7分為陽性。

    1.4qRT-PCR 用Trizol提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,Wnt7a/Fzd5的PCR體系包括:SYBR Premix (SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ kit,Takara,大連)10 μl,Wnt7a/Fzd5上、下游引物分別為0.5 μl,cDNA 1 μl,去離子水8 μl。以β-actin作為內(nèi)參照,體系配制包括:SYBR Premix 10 μl,β-actin上、下游引物各0.3 μl,去離子水8.4 μl。引物由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成,引物信息見表1。在熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TM Real-Time System)中進(jìn)行擴(kuò)增。Wnt7a及Fzd5的相對表達(dá)量通過檢測相對循環(huán)閾值(2-ΔΔCt) 來獲得。

    表1 qRT-PCR引物信息表

    1.5Western印跡 提取組織總蛋白,并在酶標(biāo)儀中測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μl,并將蛋白變性。常規(guī)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,分別孵育一抗Wnt7a及Fzd5(濃度分別為1∶1 000),4℃過夜。分別在辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠及抗兔的二抗中孵育,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行發(fā)光。

    1.6統(tǒng)計學(xué)分析 使用Prism5.01軟件(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,Wnt7a及Fzd5之間的相關(guān)性及與大腸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用Spearman分析。

    2 結(jié) 果

    2.1Wnt7a在大腸癌組織及癌旁正常組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,Wnt7a的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀,主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。腫瘤組織內(nèi)Wnt7a陽性表達(dá)率為82%,明顯高于癌旁正常組織35%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR及Western印跡結(jié)果顯示,與正常腸黏膜(1.267±0.203,0.250±0.066)相比,腫瘤組織內(nèi)Wnt7a在mRNA(2.574±0.487)及蛋白(0.750±0.250)水平均明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,圖2。

    2.2Fzd5在大腸癌組織及癌旁正常組織的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,F(xiàn)zd5的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀,主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。腫瘤組織Fzd5的陽性表達(dá)率為87%,明顯高于癌旁正常組織的41%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR及Western印跡結(jié)果顯示,與正常腸黏膜(1.353±0.238,0.412±0.491)相比,腫瘤組織內(nèi)Fzd5 mRNA(2.694±0.463)及蛋白(0.869±0.156)水平均明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1,圖2。

    圖1 Wnt7a、Fzd5在大腸癌及正常腸黏膜中的表達(dá)(免疫組化,Bar=25 μm)

    圖2 Western印跡檢測Wnt7a、Fzd5在大腸癌及正常腸黏膜中的表達(dá)

    2.3大腸癌中Wnt7a及Fzd5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Wnt7a及Fzd5的表達(dá)與患者的年齡、性別、分化程度無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與腫瘤大小、Duke分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 大腸癌組織中Wnt7a與Fzd5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    2.4大腸癌中Wnt7a及Fzd5表達(dá)的相關(guān)性 大腸癌組織內(nèi)Wnt7a及Fzd5的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.712,P<0.05)。

    3 討 論

    Wnt信號通路在胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔6〕。Wnt信號的起始為Wnt配體與靶細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合,引起信號的傳遞,導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生一系列生理反應(yīng)或病理變化。Wnt配體通過與不同受體的結(jié)合介導(dǎo)不同的效應(yīng)過程〔7,8〕。Fzd受體,由Frizzled基因編碼,屬于7次跨膜蛋白受體家族。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌的方式與細(xì)胞膜上的Fzd受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),參與正常胚胎發(fā)育和各種疾病過程。研究發(fā)現(xiàn),多種Wnt信號分子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔9,10〕。Wnt7a是一種分子量約39 kD的糖蛋白,是Wnt信號家族中的一員,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔11〕。在乳腺癌,Wnt7a的表達(dá)與結(jié)締組織及患者預(yù)后不良有關(guān)〔12〕;也有研究表明,Wnt7a的活化抑制了肺癌及白血病細(xì)胞的增殖〔11〕;Wnt7a與受體Fzd9的相互作用抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長,促進(jìn)了細(xì)胞的分化〔13〕;有研究發(fā)現(xiàn),Wnt7a可能會促進(jìn)大腸癌發(fā)生發(fā)展,但具體機(jī)制尚未明確。

    本實驗結(jié)果提示,Wnt7a在大腸癌中的作用可能通過與受體Fzd5的結(jié)合從而介導(dǎo)Wnt信號的傳導(dǎo)有關(guān)。Wnt7a的受體可能存在多種,譬如Fzd9、ROR1/2〔13〕等,而Wnt信號與不同受體的結(jié)合可能會介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中,Wnt7a是否與其他受體結(jié)合及作用將是下一步研究的重點,而Wnt7a與不同受體結(jié)合有可能成為大腸癌治療的潛在靶點。

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