泛醌細胞色素C還原酶核心蛋白1基因甲基化與阿爾茨海默病發(fā)病風險的相關性

王 靜 趙 晴 徐亞南 孔祥怡 叢樂樂 李松濤

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

阿爾茨海默病(AD)是老年人認知功能障礙最常見的癡呆類型〔1〕，其特征在于不可逆的記憶喪失和認知能力下降〔2〕。AD的發(fā)病受諸多因素的影響，其中表觀遺傳學在AD的發(fā)病早期發(fā)揮重要作用〔3,4〕。DNA甲基化是基因調(diào)控常見的表觀遺傳學之一，近幾年的研究檢測到AD患者體內(nèi)多個AD相關基因的甲基化水平與正常人存在明顯差異〔5〕，外周血中基因甲基化有可能成為早期診斷AD的指標。泛醌細胞色素C還原酶核心蛋白(UQCRC)1基因是編碼線粒體呼吸作用復合體Ⅲ(呼吸鏈的重要組成部分)的一個亞基,線粒體功能障礙在AD發(fā)病過程中起著關鍵作用,當UQCRC1基因發(fā)生甲基化時可能造成線粒體呼吸鏈功能障礙，與AD的發(fā)病可能有一定的關系。本研究分析AD患者外周血中UQCRC1基因甲基化狀態(tài)，旨在探討UQCRC1基因啟動子區(qū)甲基化與AD發(fā)病風險的相關性，以期尋找可以早期診斷AD的檢測方法，同時為AD提供一個新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗對象 AD組選取2015年9月至2016年12月吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科記憶障礙門診及住院部收治的老年AD患者，同時選取吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心與AD組年齡、教育程度、血壓、身體基本情況等基線資料相匹配的非AD患者為對照組。研究對象共105例，AD組50例，對照組55例。兩組一般資料包括性別、年齡、高血壓、糖尿病史、飲酒史、高密度脂蛋白、吸煙史、同型半胱氨酸、纖維蛋白原、低密度脂蛋白、谷草轉氨酶、載脂蛋白A1、谷丙轉氨酶、肌酐、總膽固醇、空腹血糖、三酰甘油、葉酸、載脂蛋白B 等比較，未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會已批準本研究，所有研究對象簽署知情同意書。AD診斷標準：采用美國精神病學會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第4修訂版(DSM-Ⅳ)中AD的診斷標準〔6〕。排除標準：(1)伴嚴重的肝、腎、心、肺功能障礙的患者；(2)伴重度的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及嚴重感染性疾病和中毒性腦病的患者；(3)抑郁癥患者；(4)有精神病史，先天性精神發(fā)育遲緩；(5)有腦卒中、頭部創(chuàng)傷史患者；(6)有吸毒史。

1.1.2主要試劑及儀器 全基因組DNA提取試劑盒購自promega公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(59824)和EpiTect MSP Kit(206143)購自QIAGEN公司；DNA Marker、上樣緩沖液購自Takara公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司；無水乙醇、異丙醇、70%乙醇購自北京化工；TAE(1×)、綠如藍染料、1.5 ml無菌微型離心管、無菌移液頭購自上海生工；臺式低溫高速離心機、恒溫水浴鍋、實時定量PCR儀、電泳儀、超低溫冰箱、全自動凝膠成像系統(tǒng)、微量加樣器、分析天平、臺式離心機、渦旋振蕩器由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院科研中心提供； UQCRC1基因甲基化引物、非甲基化引物通過MethPrimer軟件設計，由上海生工合成；引物序列：UQCRC1甲基化引物：上游5'GTT TTA AGT GAT TTA TTT GTT TCG G3′，下游5′TTT CTC CAT ATT AAC CAA TTT TAC G3′，擴增長度131 bp；UQCRC1非甲基化引物：上游5'GTT TTA AGT GAT TTA TTT GTT TTG G3′，下游5′ATT TCT CCA TAT TAA CCA ATT TTA CAC3′，擴增長度132 bp。

1.2DNA的提取、DNA亞硫酸氫鹽修飾、甲基化特異性PCR(MSP) 于清晨空腹應用EDTA抗凝管采血8 ml，3 000 r/min離心10 min，吸取中間白細胞層，分裝在與實驗樣本對應編號的1.5 ml Eppendoff管，于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標本庫-80℃冰箱保存待用；集中檢測。首先解凍-80℃白細胞樣品(白細胞/紅細胞混合物)，嚴格按照DNA提取試劑盒操作說明書提取DNA樣品，然后嚴格按EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(59824)操作說明書對提取的純度較高的DNA樣品進行亞硫酸氫鹽修飾，最后采用UQCRC1基因甲基化引物及非甲基化引物進行PCR擴增。PCR反應總體積為25 μl，包括EpiTect Master Mix 12.5 μl，上游引物及下游引物各0.5 μl,亞硫酸氫鹽修飾后的DNA模板1 μl，RNase-free水10.5 μl。PCR擴增條件：預變性95℃，10 min；擴增(40個循環(huán))：變性94℃，15 s；退火50℃，30 s；延伸：72℃，30 s；最后延伸：72℃，10 min。PCR擴增的結果，利用凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)進行檢測，如果UQCRC1基因發(fā)生甲基化，以甲基化引物擴增的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)條帶；如果未發(fā)生甲基化，以非甲基化引物擴增的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)條帶。

表1 AD組與對照組一般資料比較

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗，進行t檢驗前對計量資料進行方差齊性檢驗，UQCRC1基因甲基化與AD相關性分析采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1MSP法檢測基因甲基化 AD組中樣本1、樣本2由甲基化引物擴增的產(chǎn)物出現(xiàn)相應條帶，說明樣本1和樣本2發(fā)生甲基化改變。對照組中樣本1由非甲基化引物擴增的產(chǎn)物出現(xiàn)相應的條帶，說明對照組樣本1未發(fā)生甲基化改變；對照組樣本2由甲基化引物擴增的產(chǎn)物出現(xiàn)相應條帶，說明樣本2發(fā)生甲基化。見圖1。

Marker:2 000 bp DNA； U:非甲基化 M:甲基化圖1 AD組與對照組凝膠電泳

2.2AD組與對照組甲基化結果 AD組中有32例(64.00%)發(fā)生甲基化，對照組中有14例(25.45%)發(fā)生甲基化，兩組甲基化率比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=15.807，P<0.05)。

2.3在AD組中UQCRC1基因甲基化按性別、年齡分層比較 對AD組進一步按性別、年齡分組，發(fā)現(xiàn)UQCRC1基因甲基化與性別無關，差異無統(tǒng)計學意義〔男性甲基化16例(61.54%，16/26)，女性為16例(66.67%，16/24)，χ2=0.142，P>0.05〕，與年齡有關，年齡可能為其危險因素〔≥65歲組甲基化29例(74.36%，29/39)，<65歲組為3例(27.27%，3/11)，χ2=8.256,P<0.05〕。

3 討 論

研究表明：DNA甲基化介導的調(diào)節(jié)在包括AD在內(nèi)的幾種慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展中起關鍵作用〔7〕。DNA甲基化是AD非常重要的表觀遺傳學機制，它通常表現(xiàn)為通過DNA的甲基化抑制基因的表達〔8〕。Smith等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)位于髓細胞觸發(fā)受體(TREM)2基因轉錄起始位點上游289 bp的CpG位點在AD患者大腦的顳上回呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)。在一項中國人群的研究發(fā)現(xiàn)UQCRC1基因在AD患者中高度甲基化，甲基化率高達97.3%〔10〕。國外的一項前瞻性研究分析表明AD易感基因的甲基化水平與AD病理改變相關，并且附近基因的表達水平也發(fā)生了改變，例如ATP-結合盒A7基因(ABCA7)和橋連整合蛋白(BIN)1基因〔11〕。Ji等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)κ阿片受體(OPRK)1基因啟動區(qū)甲基化與AD發(fā)病的風險顯著相關。隨著基因檢測技術的提高，越來越多與AD相關的易感基因被發(fā)現(xiàn)，其中一些易感基因的甲基化狀態(tài)與AD的發(fā)生發(fā)展高度相關〔13，14〕，未來希望建立一個AD易感基因譜。

目前關于AD的發(fā)病機制中，線粒體級聯(lián)假說受到越來越多人的關注。有研究報道腦內(nèi)的線粒體功能和葡萄糖代謝的改變是導致AD發(fā)病的前因，正電子發(fā)射斷層攝影術(PET)檢查顯示AD患者腦組織氧化和能量代謝受損，AD患者腦部對葡萄糖的吸收和利用與正常人相比減少21%～28%〔15〕。Swerdlow等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者的腦組織存在Tau蛋白磷酸化、細胞周期重返和淀粉樣變性可能為線粒體功能障礙引起，可以很好地解釋非孟德爾遺傳因素導致的非常染色體顯性遺傳性AD的發(fā)病。線粒體功能障礙的特征在于缺乏關鍵呼吸酶的活性并且伴隨著活性氧的產(chǎn)生和積累。隨著β淀粉樣蛋白(Aβ)積聚，它會損害腦血流量，導致更少的葡萄糖可用于能量消耗，繼續(xù)惡性循環(huán)會加劇受損的腦血流量并導致神經(jīng)元變性，最終導致AD的發(fā)病〔17～19〕。Mancuso等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織中線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表達都下降，細胞色素C氧化酶活性降低。有研究表明，在神經(jīng)纖維纏結形成之前，線粒體內(nèi)細胞色素C氧化酶與線粒體DNA的水平有所改變，線粒體異常是AD病理的早期特征〔21〕。 Sorrentino等〔22〕利用線蟲和小鼠作為模式生物，發(fā)現(xiàn)提高線粒體抵抗特定蛋白的應激能力，能夠讓他們不僅保護自我，而且也會降低淀粉樣蛋白斑塊的形成。研究發(fā)現(xiàn)具有各種載脂蛋白E4等位基因的AD患者有線粒體功能障礙〔23,24〕。以上研究說明線粒體功能障礙可能在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。UQCRC1是編碼線粒體呼吸作用復合體Ⅲ(呼吸鏈的重要組成部分)的一個亞基，對維護線粒體正常功能至關重要。以往研究表明UQCRC1基因甲基化與腫瘤關系密切，如乳腺癌、卵巢癌及骨肉瘤、結腸癌等〔25〕。隨著線粒體級聯(lián)假說深入的研究，UQCRC1基因甲基化與AD的關系也獲得了研究人員的關注。Ma等〔10〕的一項研究表明UQCRC1甲基化與AD發(fā)病風險顯著相關。Lardenoije等〔26〕研究了幾種AD動物模型中DNA甲基化和年齡的相關性，發(fā)現(xiàn)年齡相關的DNA甲基化增加。性別是AD發(fā)病風險的一個重要因素，部分原因是因為絕經(jīng)后女性失去了雌激素對神經(jīng)元線粒體抗Aβ毒性的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)老年女性比年齡相當?shù)哪行愿菀谆继悄虿『头逝值却x性疾病，增加患AD的風險〔27〕。目前關于性別與UQCRC1基因甲基化相關性未見報道，本實驗性別與UQCRC1基因甲基化水平無相關性，而在 Lardenoije等〔26〕的動物模型中，發(fā)現(xiàn)在3XTg-AD小鼠模型中基因甲基化與年齡之間顯著相關,由于本實驗樣本量有限，需要更多的實驗研究闡明性別對表觀遺傳變化的影響。