牛蒡根際土壤解磷菌的篩選、鑒定及生長特性

王樣庭，陳 玲，王 陶，李 文*，李同祥，劉 洵

(1.徐州工程學(xué)院/江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221018； 2.徐州萬荷奶牛專業(yè)合作社，江蘇 徐州 221113)

磷作為一種植物必需的大量元素，對植物的生長、代謝、發(fā)育起到至關(guān)重要的作用[1-2]。然而，土壤中的磷只有0.1%可被植物所用，大部分磷是以無效磷的形式存在[3]。長期以來，人們通過施用磷肥來解決這一問題，然而，磷會和土壤中的金屬離子如Al3+、Fe3+、 Ca2+等結(jié)合，轉(zhuǎn)化成無效形式，并造成土壤肥力及生物多樣性下降等問題[4]。因此，提高磷的有效性是當務(wù)之急[5]。土壤中存在一類解磷微生物，可以將無效磷轉(zhuǎn)變成植物能吸收的狀態(tài)，從而促進植物的生長[6]。解磷微生物可以分為解磷細菌、真菌和放線菌，其中，解磷細菌按其種屬可分為腸細菌屬(Enterbacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、歐文氏菌屬(Er-winia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、固氮菌屬(Azotobacter)、色桿菌屬(Chromabacterium)、沙門氏菌屬(Salmonella)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)細菌屬(Arthrobacter)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)；解磷真菌方面的相關(guān)研究報道不多，大多為曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、小菌核菌屬(Sclerotium)、AM菌根菌(Arbuscularmycorrhiza)等；解磷放線菌的研究主要側(cè)重于鏈霉菌屬(Streptomyces)[7-9]。解磷微生物作為傳統(tǒng)磷肥的一個良好的替代品，除了可以釋放磷元素供植物生長所需，還可以維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的長期平衡[10]，從而緩解施用磷肥帶來的環(huán)境問題。因此，篩選高效解磷微生物以研制具有高解磷能力的生物肥料迫在眉睫。通常，分離自不同土壤的解磷菌在生長和解磷性能上呈現(xiàn)出較大的差異。因此，對于不同解磷菌的分離鑒定及生長特性的研究具有重要意義，能夠豐富野生解磷菌資源，并為解磷菌的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。

牛蒡 (ArctiumlappaL.)，俗稱東洋參，是菊科牛蒡?qū)俨荼局参铮哂锌寡趸?、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種藥理活性[11]，江蘇省徐州市的沛縣、豐縣是中國主要的種植地區(qū)。對牛蒡根際促生細菌如解磷菌進行研究有助于提高牛蒡的產(chǎn)量，更好地發(fā)揮其功效。目前，關(guān)于土壤解磷細菌的篩選、鑒定研究較多，多篩選于小麥、大豆、棉花、花生、煙草、油茶、茶樹等的根際土壤，并具有較好的解磷特性[12-24]，而對牛蒡根際解磷菌的研究鮮有報道。為此，從牛蒡根際土壤中篩選具有優(yōu)良解磷性能的菌株，并對其進行鑒定，研究其生長特性，以期為開發(fā)牛蒡?qū)Ｓ镁侍峁┮欢ǖ睦碚搮⒖己图夹g(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤 土樣為徐州市豐縣牛蒡根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、Ca3(PO4)2 25.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.5 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 值6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：無機磷液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，使其終質(zhì)量濃度為18 g/L。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、牛肉浸膏2.50 g，加蒸餾水至500 mL，pH值 7.0左右，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，使其終質(zhì)量濃度為18 g/L。

1.1.3 儀器設(shè)備 HYG 旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司)，HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，DL-5 低速大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，PCR 擴增儀(BioRad,USA)，電泳儀、電泳槽(DYY-2C型)(北京市六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)CDS8000(上海培清科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌的篩選

1.2.1.1 初篩 稱取5 g土樣放入盛有 45 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，置搖床上100 r/min振蕩15 min，靜置，采用梯度稀釋法將上清液分別稀釋至10-3、10-4、10-5三個稀釋度，取0.1 mL稀釋液涂布至篩選平板，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。解磷圈直徑(H)、菌落生長直徑(C)的比值(H/C)越大，表示解磷菌解磷能力越強，以此初步測定菌株降解無機磷的能力[25]。

1.2.1.2 復(fù)篩 測解磷圈大小只是定性檢測菌株的解磷特性，解磷菌解磷能力的衡量還需結(jié)合定量法，通過測定上清液中磷的質(zhì)量濃度來確定菌株解磷能力的強弱。將初篩菌株接種于 LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h，得種子液。再將種子液以1%接種量接入無機磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為對照，于30 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)0～5 d。8 000 r/min 離心 15 min，采用磷鉬藍比色法測定上清中的磷含量[26]。

1.2.2 解磷菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征鑒定 將菌株劃線接種于LB平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察單菌落的形態(tài)特征，另取新鮮培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，觀察其顯微形態(tài)。

1.2.2.2 生理生化特性鑒定 生理生化試驗參照文獻[27-28]的方法進行。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 按照文獻[29]的方法提取解磷菌基因組DNA，采用細菌16S rDNA通用引物[30]進行PCR擴增。上游引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R序列為5′-GGCTACCTTGTTACGACT-3′。反應(yīng)體系為DNA 1 μL、10×EasyTaqbuffer 2.5 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL、高純dNTP 2 μL，加雙蒸水至總體積為25 μL。擴增的反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工(上海)生物工程股份有限公司測序，所得序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)與已有細菌的16S rDNA序列比對；同時，將序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫，進行同源性搜索，找出與所得基因序列同源性最高的已知菌種，同時，提取部分與所測菌株的16S rDNA序列同源性較高的已知菌株的16S rDNA序列，利用ClustalX 1.83軟件進行序列多重比對，利用MEGA 6.0軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(自展值為1 000)，鑒定解磷菌與已知菌株的同源性。

1.2.3 解磷菌的生長特性

1.2.3.1 解磷菌生長曲線 將解磷菌接入盛有120 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并設(shè)無菌對照，置搖床中30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定OD600值。以時間為橫坐標、OD600為縱坐標，繪制解磷菌的生長曲線。

1.2.3.2 溫度對解磷菌生長的影響 將種子液以1%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，分別置于18、20、26、28、30、32、34、37、40、42 ℃下，于搖床中150 r/min培養(yǎng)48 h，以不接菌的培養(yǎng)基為對照，測定菌懸液的OD600值。

1.2.3.3 pH值對解磷菌生長的影響 將種子液以1%的接種量接入pH值分別為4.5、5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液體培養(yǎng)基中，于搖床中150 r/min培養(yǎng)48 h，以不接菌的培養(yǎng)基為對照，測定菌懸液的OD600值。

1.2.3.4 NaCl質(zhì)量濃度對解磷菌生長的影響 將種子液以1%的接種量接入NaCl質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、70 g/L的LB液體培養(yǎng)基中，于搖床中150 r/min培養(yǎng)48 h，以不接菌的培養(yǎng)基為對照，測定菌懸液的OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡根際土壤中解磷菌的篩選

2.1.1 初篩 將不同稀釋度的土壤菌懸液涂布在篩選培養(yǎng)基上進行初步篩選，共獲得產(chǎn)解磷圈明顯、H/C值介于1.1～1.5的菌株48株，其中，JL-1長勢良好，所產(chǎn)解磷圈最明顯，經(jīng)測量，其H/C值為1.5(圖1)。

圖1 初篩所得菌株產(chǎn)生的解磷圈

2.1.2 復(fù)篩 將初篩所得48株菌進行液體發(fā)酵，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液上清中的磷含量介于26.84～49.56 μg/mL。其中，JL-1的解磷量最高，為49.56 μg/mL，進一步測定其動態(tài)解磷過程，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，菌株JL-1具有較強的解磷能力，且解磷速度較快，2 d后解磷量達到峰值，為50.4 μg/mL，之后略有下降，這可能是由于在發(fā)酵初期培養(yǎng)基養(yǎng)分充足，菌體呈指數(shù)增長，能快速分解磷酸鈣；而后隨著營養(yǎng)的耗盡，微生物活性下降,其中的可溶性磷有可能和發(fā)酵液中的金屬離子等結(jié)合,成為不溶態(tài),導(dǎo)致解磷總量下降[31]。

圖2 菌株JL-1的解磷進程

2.2 牛蒡根際土壤中解磷菌株JL-1的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征鑒定 菌株JL-1的菌落形態(tài)特征為：淡黃色，略微凸起，邊緣不整齊，菌落較為濕潤；革蘭氏染色呈陰性，菌體呈桿狀(圖3)。

圖3 菌株JL-1的單菌落形態(tài)(左)及細胞形態(tài)(右)

2.2.2 生理生化特性鑒定 由表1可知，菌株JL-1的葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉水解、甲基紅、接觸酶、明膠液化、檸檬酸鹽利用試驗均呈陽性，VP、氧化酶、吲哚、H2S產(chǎn)生、脲酶、硝酸鹽還原試驗均呈陰性。

表1 菌株JL-1的生理生化特性

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株JL-1基因組DNA為模板，PCR擴增JL-1的16S rDNA序列，經(jīng)電泳可見，在1 200～1 500 bp處出現(xiàn)清晰條帶(圖4)。

經(jīng)測序，該序列全長為1 337 bp(圖5)。

圖4 16s rDNA PCR擴增產(chǎn)物

圖5 JL-1菌株的16S rDNA序列

將測序得到的序列利用BLAST進行比對，同時，將此序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫，進行序列同源性比對，結(jié)果顯示，該菌株與不動桿菌屬(Acinetobacter)的菌株呈高度同源性，表明此菌株屬于不動桿菌屬，與此菌株同源性最高的為Acinetobacterindicus，相似性為100% ，選取同源性較高的菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JL-1與AcinetobacterindicusCIP 110367 K1530754聚在一起，自展值為100，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。結(jié)合之前的形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA比對結(jié)果，最終確定該菌株為Acinetobacterindicus。將此菌株的16S rDNA序列提交至NCBI 的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MF497336。

圖6 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 牛蒡根際土壤中解磷菌株JL-1的生長特性

2.3.1 解磷菌株JL-1的生長曲線 菌株JL-1的生長曲線如圖7所示，菌株生長迅速，延滯期很短，2 h后即進入對數(shù)期，12 h后進入穩(wěn)定期，22 h后進入衰亡期，當菌體處于對數(shù)中后期時，細胞生長迅速，代謝旺盛，此時期的菌體適于作為種子液以利于后續(xù)的擴培。

圖7 菌株JL-1的生長曲線

2.3.2 溫度對解磷菌株JL-1生長的影響 菌株JL-1在不同溫度下的生長情況見圖8，可以看出，菌株可生長的溫度范圍較寬，在20～40 ℃條件下皆可生長，且隨著溫度的升高，菌體量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。其中，在 26～37 ℃條件下，菌體量較高，說明此溫度范圍有利于菌株的生長；菌株的最適生長溫度為30 ℃。

圖8 溫度對菌株JL-1生長的影響

2.3.3 pH值對解磷菌株JL-1生長的影響 由圖9可知，pH值低于4.5或高于9.0時，菌株無法生長，在pH值4.5～9.0時，隨著pH值的升高，OD600值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。菌株較適生長的pH值為6.5～8.0，最適生長pH值為7.0。

圖9 pH值對菌株JL-1生長的影響

2.3.4 NaCl質(zhì)量濃度對解磷菌株JL-1生長的影響 由圖10可以看出，當NaCl質(zhì)量濃度在0～10 g/L時，菌體量呈升高趨勢，可見較低的NaCl質(zhì)量濃度能夠促進菌株的生長；當NaCl質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，菌體生長逐漸受到抑制，當質(zhì)量濃度大于60 g/L時，菌株幾乎不生長?？梢?，菌株可以耐受NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L，最適合其生長的NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖10 NaCl質(zhì)量濃度對菌株JL-1生長的影響

3 結(jié)論與討論

本研究從土壤中篩選獲得1株具有較好解磷效果的細菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為不動桿菌屬(Acinetobacter)中的Acinetobacterindicus。不動桿菌屬細菌在自然界廣泛存在，目前，不動桿菌屬中已經(jīng)被正式命名的共有37 個種[32]，其可以在潮濕和干燥的表面生存，是重要的土壤微生物，具有代謝多樣性，可以降解己內(nèi)酰胺、除草劑、農(nóng)藥、石油烴組分等，但尚未見Acinetobacterindicus降解磷的報道。因此，本試驗篩選所得AcinetobacterindicusJL-1從一定程度上豐富了野生解磷菌資源。

土壤重要的理化指標有酸堿度、溫度、鹽度等。土壤環(huán)境復(fù)雜，具有較大的溫度、酸堿度、鹽度變化等特征[33]。對AcinetobacterindicusJL-1的生長特性研究表明，該菌株生長較快,在溫度26～37 ℃、pH值6.5～8.0條件下，生長較好，最適溫度為30℃，最適pH值為7.0；可以耐受NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L，生長最適NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L。綜上，該菌株可以在較復(fù)雜的環(huán)境條件下生長，具有較好的應(yīng)用前景。