耐低溫玉米自交系的篩選及其葉片生理特性和細胞結構變化

李 波，方志堅

(齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院/抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米是東北地區(qū)種植的主要作物，其播種面積和總產量均較高[1]。早春低溫冷害形成該區(qū)域特有的生態(tài)氣候條件，對作物種子生活力產生不良影響[2]。玉米是溫度敏感型作物，對溫度條件要求較高，耐受冷害能力較弱。因此，北方玉米種植區(qū)玉米產量不可避免地受到春播低溫的影響[3-4]。近年來，關于玉米低溫冷害以及緩解低溫冷害對玉米生產的影響方面已有研究。低溫脅迫的玉米植株，葉片光合系統(tǒng)受到抑制，植株的正常生長發(fā)育受到影響[5-6]。針對玉米遭遇低溫冷害的現(xiàn)象，可以通過加入適宜濃度的外源物質[7]、噴施冠菌素(COR)[8]、加入外源脯氨酸(Pro)和甜菜堿(GB)[9]等方法進行緩解。但以往這些研究主要集中在不同品種玉米種子萌發(fā)、幼苗生長和生理生化方面。在玉米不同的生長階段，低溫對營養(yǎng)生長和生殖生長均產生不同程度的影響[10]，因低溫引起玉米葉片超微結構變化的相關研究鮮見報道。另外，選育耐冷性較強的品種或自交系，探索提高玉米種子抗(耐)冷能力的技術體系，是應對早春低溫冷害的有效措施。不同品種對低溫的耐受能力不同，其幼苗生理特性往往不同。鑒于此，研究了不同玉米自交系幼苗的耐低溫能力，并對耐低溫能力不同的玉米自交系的抗逆生理特性進行初步探討，以篩選適宜東北地區(qū)春季早播的耐低溫玉米自交系，同時為培育耐低溫玉米新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的91份玉米自選自交系種子為材料，具體編號和名稱見表1。

表1 玉米自交系材料及編號

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫處理 采用0.1% HgCl2對玉米種子進行消毒，然后均勻播種在裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽內，每天定期觀察和統(tǒng)計出苗率，待幼苗長到3葉1心期，將部分幼苗移入培養(yǎng)箱進行低溫處理：3 ℃處理5 d，3次重復，每次重復20株幼苗，之后在25 ℃人工氣候箱中恢復生長3 d后，計算其相對存活率，并根據(jù)相對存活率對玉米自交系的耐低溫等級進行分類。

選擇不同耐低溫等級玉米自交系種子6份，在裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽內培養(yǎng)至3葉1心期后，移入7 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫處理，25 ℃人工氣候箱恢復生長3 d，選取功能葉片用于生理生化指標測定和透射電鏡切片的制作。

1.2.2 生理生化指標測定 對不同耐低溫等級的玉米自交系幼苗進行8項生理指標的測定[11]：可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，可溶性糖、丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量測定采用茚三酮法，相對電導率測定采用電導法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑光化還原法，各指標測定均重復3次。

1.2.3 透射電鏡切片的制作 選擇耐低溫能力強弱不同的2個自交系，取幼苗葉片(3葉1心期中間葉片)中部，切割成2～4 mm小塊→2.5%戊二醛固定2 h→0.1 mol/L磷酸液沖洗30 min→2%四氧化鋨固定2 h→蒸餾水沖洗30 min→30%、50%、70%、80%乙醇4 ℃脫水各15 min→90%、95%乙醇室溫各15 min→100%乙醇和100%環(huán)氧丙烷室溫各20 min→環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂3∶1、1∶1、1∶3分別滲透1 h、2 h、2 h→60 ℃恒溫箱聚合36 h→1 μm半薄切片→醋酸雙氧鈾染色30 min→超薄切片→日立H-7650型透射電鏡觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用分析軟件Excel 2003、SPSS 17.0對所測指標數(shù)據(jù)進行方差分析，比較8項生理生化指標的差異及其顯著性。

通過8項指標的低溫處理與對照的測定值計算抗寒系數(shù)，再利用抗寒系數(shù)計算隸屬值，應用隸屬函數(shù)法對玉米自交系抗逆性進行綜合評價[12-13]。

抗寒系數(shù)=低溫處理測定值/對照測定值；

隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；反隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；式中，Xi為指標測定值，Xmin、Xmax分別為某項指標的最小值和最大值。將耐低溫能力隸屬值進行累加求出平均數(shù)：X=ΣU(Xi)/n，X為所求平均抗性的隸屬值。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對玉米自交系幼苗相對存活率的影響

由圖1可見，91份玉米自交系幼苗在3 ℃低溫處理后相對存活率差異極大，在同一低溫脅迫處理下，相對存活率最高為83.33%，最低為0。依據(jù)低溫脅迫下玉米幼苗的相對存活率，對91份玉米自交系的耐低溫等級進行分類，共分6級(表2)，其中，11號自交系幼苗相對存活率為83.33%，為91份材料中耐低溫能力極強的自交系；其次為12、16、33、34、36、83號自交系，對低溫有強耐性，幼苗相對存活率分別為78.57%、74.07%、75.86%、71.43%、72.00%、62.96%；耐低溫能力中強的自交系7份，分別為5、8、35、41、42、78、81號自交系，幼苗相對存活率分別為50.00%、50.00%、50.00%、45.45%、41.18%、46.15%、41.6%。此3類玉米自交系共14個，耐低溫能力較強，占供試自交系的15.38%；其他自交系幼苗相對存活率均低于50%，且91份材料中有45份自交系幼苗相對存活率為0，占49.45%，為不耐低溫的自交系。

圖1 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的相對存活率

耐低溫等級相對存活率/%材料數(shù)/份自交系編號極強100～80111強79～60612、16、33、34、36、83中強59～4075、8、35、41、42、78、81 弱39～1322、3、4、6、7、9、10、13、18、20、21、22、24、25、26、29、30、32、44、47、48、50、52、53、56、57、60、66、68、70、80、89不耐0451、14、15、17、19、23、27、28、31、37、38、39、40、43、45、46、49、51、54、55、58、59、61、62、63、64、65、67、69、71、72、73、74、75、76、77、79、82、84、85、86、87、88、90、91

根據(jù)表1中的耐低溫等級分類結果，選擇6份耐低溫等級不同的玉米自交系，分別為11、33、35、6、1、46號自交系，經7 ℃低溫脅迫后，比較幼苗葉片的生理特性差異。

2.2 不同耐低溫等級玉米自交系的生理特性及其耐低溫綜合評價

2.2.1 可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量 由圖2可見，低溫脅迫下6份玉米自交系幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均有不同程度的增加，46、1、35、6、33、11號自交系的可溶性糖含量分別為對照的1.29、1.09、1.41、1.27、1.52、1.45倍，且以11號自交系的可溶性糖含量最多；可溶性蛋白含量分別為對照的1.17、1.28、1.41、1.24、1.51、1.47倍，且以33號自交系可溶性蛋白含量最多；脯氨酸含量分別為對照的1.11、1.29、1.35、1.30、1.43、1.51倍，脯氨酸積累量最多的為11號自交系。可見，低溫脅迫促進玉米自交系可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的積累，但不同耐低溫等級玉米自交系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸積累程度不同，耐低溫能力強的自交系3種滲透調節(jié)物質含量增幅加大。

不同小寫字母表示同一處理下不同自交系在0.05水平上差異顯著，下同

2.2.2 MDA含量和相對電導率 MDA含量和相對電導率的變化反映低溫對膜引起的膜脂過氧化作用。由圖3可見，低溫脅迫下，46、1、35、6、33、11號玉米自交系幼苗葉片的相對電導率分別為對照的1.19、1.29、1.10、1.12、1.11、1.10倍，MDA含量分別為對照的1.37、1.45、1.32、1.24、1.21、1.23倍，其中，以11號玉米自交系的相對電導率和MDA含量最低。從MDA含量和相對電導率的變化分析，耐低溫能力強的玉米自交系葉片細胞膜的損傷比較小，而耐低溫能力差的自交系葉片細胞膜損傷比較大。

圖3 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的MDA含量和相對電導率

2.2.3 POD、CAT、SOD活性 由圖4可見，低溫脅迫提高了46、1、35、6、33、11號玉米自交系的3種抗氧化酶活性，POD活性分別為對照的1.29、1.28、1.56、1.38、1.79、1.64倍，CAT活性分別為對照的1.31、1.59、1.67、1.52、2.13、1.79倍，SOD活性分別為對照的1.15、1.11、1.24、1.43、1.45、1.96倍，且POD、CAT、SOD活性均以11號自交系最高。不同耐低溫等級自交系通過促進這3種抗氧化酶活性的增加，來抵御低溫對幼苗的傷害，耐低溫能力強的自交系3種抗氧化酶活性均較高。

圖4 低溫脅迫下玉米自交系幼苗的POD、CAT、SOD活性

2.2.4 耐低溫綜合評價 對上述8項生理指標進行抗寒系數(shù)和隸屬值的計算，避免單個指標出現(xiàn)的偶然性。根據(jù)抗寒系數(shù)(表3)計算各指標的隸屬值(表4)。分析排序后的綜合評價值，綜合隸屬值越大，其耐低溫能力越強。6份玉米自交系耐低溫能力強弱為：11>33>35>6>46>1。

表3 6份玉米自交系幼苗8項生理指標的抗寒系數(shù)

表4 6份玉米自交系幼苗8項生理指標的隸屬值

2.3 低溫脅迫對玉米自交系葉片超微結構的影響

葉綠體是光合作用的場所，其內基粒整齊垛疊在一起，膜面積越大，光合能力越強。低溫等逆境脅迫對玉米自交系細胞超微結構具有一定的影響。逆境脅迫下，葉綠體結構受損，基粒溶解，基粒片層結構解體，細胞膜受損，造成光合作用受阻，細胞膜受損，細胞代謝紊亂，從而影響作物的正常生長。由于受自交系幼苗低溫脅迫功能葉片和種子數(shù)量的限制，選擇耐低溫能力強(33號)和弱(46號)自交系，觀測葉片超微結構(圖5)，對照玉米自交系葉片的細胞結構較為規(guī)則，葉綠體外膜清晰，內部基粒片層排列整齊，葉綠體內含有大量淀粉粒，部分葉綠體互相靠近，聯(lián)合在一起。線粒體均勻分布在細胞邊緣，呈橢圓形，雙層膜結構完整，內部嵴較豐富；低溫脅迫處理的玉米自交系葉片細胞結構均發(fā)生不同程度的改變，主要體現(xiàn)在相鄰細胞間隙變大，葉綠體內部結構被破壞，淀粉粒數(shù)量增加，出現(xiàn)巨型淀粉粒、類囊體膜膨脹疏松、基粒消失、葉肉細胞整體變大等現(xiàn)象。耐低溫能力強的玉米自交系葉片結構變化較小，但也出現(xiàn)輕微的質壁分離現(xiàn)象，葉綠體結構比較完整，葉綠體外膜清晰，內部基質片層排列整齊并含有大量淀粉粒。耐低溫能力弱的玉米自交系葉片細胞結構變化較大，細胞嚴重變形，質壁分離嚴重，葉綠體膜遭到破壞，局部破裂，基質外滲，葉綠體中淀粉粒大量增加，內部基質片層排列混亂，基質空間增大，基粒類囊體膨脹，發(fā)生扭曲等現(xiàn)象。

A和E分別為46號自交系低溫處理和對照的葉片細胞(2 500×)，B和F分別為46號自交系低溫處理和對照的葉片細胞間隙(5 000×)，K和P分別為46號自交系低溫處理和對照的葉綠體結構(10 000×)，L和Q分別為46號自交系低溫處理和對照的葉綠體結構(20 000×)；C和G分別為33號自交系低溫處理和對照的葉片細胞(2 500×)，D和H分別為33號自交系低溫處理和對照的葉片細胞間隙(5 000×)，M和R分別為33號自交系低溫處理和對照的葉綠體結構(10 000×)，N和S分別為33號自交系低溫處理和對照的葉綠體結構(20 000×)；CW.細胞壁； Chl.葉綠體； GL.基粒片層； SL.基質片層； OG.嗜鋨顆粒； SG.淀粉粒； CM.葉綠體膜； Cr.嵴

3 結論與討論

3.1 低溫對玉米葉片滲透調節(jié)、膜透性和抗氧化能力的影響

植物在逆境環(huán)境下通過主動積累各種有機物來提高細胞液濃度，降低細胞滲透勢，提高細胞保水力，以適應逆境脅迫的影響[14-16]。細胞內合成的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等多種有機物質是植物體內最有效的滲透調節(jié)物質。相關研究表明，低溫脅迫下，植物體內的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加[17]，從而增強植物的抗逆境能力。本研究結果顯示，抗性強的玉米自交系較抗性差的自交系積累更多的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，從而增強耐低溫能力。在所選擇的6份耐低溫能力不同的玉米自交系中，耐性強的自交系農M6和WM40-2在低溫脅迫下這3種滲透調節(jié)物質積累更多。

植物在受到逆境脅迫時，膜透性發(fā)生改變，MDA含量和相對電導率增加[18-19]。因此，MDA含量和相對電導率的高低與細胞膜的傷害程度呈正相關。低溫能改變玉米幼苗葉片細胞的通透性，其變化大小受外界低溫強度和作用時間長短以及不同品種耐低溫能力不同影響。溫度越低，細胞膜損傷越嚴重，細胞膜透性越大。本研究中，低溫條件下，耐低溫能力強的玉米自交系農M6和WM40-2滲透率較低，質膜相對穩(wěn)定。

植物的低溫脅迫抗性與活性氧清除能力密切相關[20]，植物抗氧化酶活性大幅度增加可緩解活性氧帶來的傷害，提高植物抗逆性。玉米幼苗在低溫脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生改變，不同自交系耐低溫能力不同的部分原因是其抗氧化酶系統(tǒng)的差異，因此，低溫脅迫下SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性的變化可作為篩選玉米耐低溫自交系的重要指標，本研究中，耐低溫能力強的玉米自交系這3種酶活性均較高。

為減少材料遺傳背景不同引起的誤差，真實地反映材料的耐低溫特性，通常采用多個性狀低溫下與常溫下的相對值作為評價指標，避免應用單一指標評價材料的耐低溫能力。試驗選擇6份不同耐低溫等級的玉米自交系幼苗，通過分析可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、MDA含量，相對電導率，POD、CAT、SOD活性8項生理生化指標的隸屬值，得出6份玉米自交系的耐低溫能力強弱為農M6>A15>A46>C3-3>南引37>澤玉119-1，與玉米幼苗相對存活率的耐低溫評價等級一致。

3.2 低溫對玉米葉片細胞結構的影響

逆境對植物細胞結構產生不同程度的影響[21]。試驗發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對玉米自交系葉片超微結構的影響主要體現(xiàn)在細胞形態(tài)和葉綠體結構上，表現(xiàn)為葉綠體緊貼細胞壁分布，細胞間出現(xiàn)了輕微質壁分離，葉綠體內基粒雜亂無章，內部其他片層的形成使類囊體片層發(fā)育受到阻礙，基粒垛疊不緊，內部結構發(fā)生改變，同時生成了大量淀粉粒，這與王雪英等[22]的研究結果相似。低溫脅迫導致葉片細胞葉綠體內含出現(xiàn)大量淀粉粒，是因為低溫影響了光合產物淀粉粒的運輸，光合速率降低；同時，低溫脅迫下嗜鋨顆粒明顯多于對照，可以保持質膜穩(wěn)定，影響植物抗逆性。低溫不僅增加淀粉粒數(shù)目，而且使淀粉粒變圓膨脹，當?shù)矸哿ｓw積增大到一定程度時，對類囊體造成損傷，最終葉綠體膜脹破，葉綠體解體，葉片失去光合作用的能力，從而影響植株的正常生長，這與周勇輝等[23]和Li等[24]的研究結果相似。

綜上，低溫脅迫下，根據(jù)玉米相對幼苗存活率篩選所得耐低溫能力強的自交系為農M6、WM40-2、C11-3、A15、A44、吉846/KL4-5、03-391。該類自交系在低溫下可積累較多的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸， 且POD、CAT、SOD活性提高，以降低對膜的傷害；同時其葉片超微結構上變化較小。因此，生產上可以選擇耐低溫能力強的玉米自交系進行配合，以提高玉米的耐低溫能力。