Nrf2信號通路在阿特拉津誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化損傷中的作用

張佳悅,陳俊宇,趙本正,吳 珊,劉 劍*,孫連平*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉133000；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，atrazine，ATR)是全球范圍廣泛使用的廣譜除草劑之一，目前，殺蟲劑和除草劑已成為農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中不可分割的一部分。據(jù)美國環(huán)保局?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)計，在北美的一些河流中，ATR的濃度高達(dá)108 μg/L。在中國，太湖和遼東河水中的ATR濃度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了3 μg/L的飲用水標(biāo)準(zhǔn)，在遼東河，ATR的濃度甚至達(dá)到18.93 μg/L[1,2]。在接觸ATR的農(nóng)民的血液和尿液中己經(jīng)檢測到了ATR污染[3]。

在墨西哥哈利斯科州Nextipac社區(qū)發(fā)現(xiàn)接觸ATR的工人存在器官和細(xì)胞水平的異常[4]。美國肯塔基州公共飲用水中的ATR也增加了當(dāng)?shù)卦袐D早產(chǎn)比率[5]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，ATR具有神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)毒性、氧化應(yīng)激損傷及腫瘤促發(fā)作用[6]，ATR的危害已經(jīng)引起學(xué)者們廣泛的重視。

大量報道中提到ATR可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[7-9]?；钚匝跎a(chǎn)增多可以導(dǎo)致DNA單或雙鏈的斷裂[10]，最近，在各種動物體內(nèi)進(jìn)行了關(guān)于ATR誘導(dǎo)的氧化損傷的研究，如小鼠、蚯蚓、魚等[10-14]。Singh[12]等人研究表明，在雄性Wistar小鼠體內(nèi)ATR可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)的活性。Jin等人[13]研究了成年雌性斑馬魚接觸ATR后在過氧化壓力下的反應(yīng)，結(jié)果顯示在肝臟中，SOD和CAT活性增高。Bhatti JS等[15]證實(shí)了ATR在小鼠紅細(xì)胞中提高丙二醛(MDA)水平，提高CAT、SOD、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。

本實(shí)驗(yàn)通過給小鼠不同劑量的ATR連續(xù)灌胃，觀察小鼠肝臟組織的活性氧水平和Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的含量，其目的是確定ATR對小鼠肝臟的氧化損傷，分析肝臟在氧化損傷下的保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1動物分組及處理

4周齡雌性C57B l/6小鼠購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，32只隨機(jī)分4組。以等體積玉米油為對照，阿特拉津分別選擇5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR[16]。小鼠以恒定溫度、恒定濕度飼養(yǎng)于該中心，小鼠連續(xù)28天每日上午灌胃，第29天麻醉下腹主動脈取血處死，取新鮮肝臟組織。

1.2主要試劑及儀器

阿特拉津?yàn)槊绹鳶igma Aldrich產(chǎn)品，純度99%，玉米油溶解。CAT檢測試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品。兔抗Nrf2、Keap1、NQO1、HO1單克隆抗體為Proteintech Group公司(美國)產(chǎn)品。羊抗兔IgG(二抗)和ECL試劑盒購自美國promega公司。其余試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品。凝膠成像系統(tǒng)(2500R)為中國Tanon生產(chǎn)，電泳儀(AE-8800)為美國Bio-rad生產(chǎn)，分光光度計(VIS-7220)為北京第二光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3檢測CAT、GSH活力和NO、MDA含量

冰上研磨制備10%肝臟組織勻漿，測定蛋白濃度(bradford法)，-20℃保存?zhèn)溆?。依照試劑盒說明書檢測肝臟組織的CAT、GSH活性及NO、MDA含量。

1.4Westernblot方法檢測Nrf2、NQO1、Keap1、HO1蛋白表達(dá)

加入液氮的同時研磨肝臟組織，冰浴條件下裂解蛋白，離心取上清，定量后取30 μg，加入緩沖液，99℃水浴，恒壓SDS-PAGE電泳(75 V 30 min，120 V 60 min)，轉(zhuǎn)膜(100 V，1 h)，牛奶封閉，TBST洗膜，封閉一抗、二抗，ECL發(fā)光顯色。GIS 凝膠成像分析系統(tǒng)分析光密度值，分別計算Nrf2、NQO1、Keap1、HO1的相對光密度(A)值(內(nèi)參β-actin)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1NO、MDA含量增高

本實(shí)驗(yàn)以生化檢測分析ATR作用下肝臟組織勻漿的活性氧水平，結(jié)果如表1顯示：濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR提高肝臟組織勻漿中NO含量，濃度125 mg/kg的ATR提高M(jìn)DA含量(與對照組相比，P<0.05)，提示ATR誘導(dǎo)小鼠肝臟組織活性氧水平增高。

表1 肝臟組織內(nèi)MDA及NO含量

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表達(dá)變化

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過western blot法分析小鼠肝臟組織中Nrf2和Keap1的蛋白含量，分析了ATR持續(xù)作用下小鼠肝臟中Nrf2的激活情況。結(jié)果如圖1，中、高ATR劑量組(25 mg/kg和125 mg/kg)相對于0 mg/kg劑量組，Nrf2的表達(dá)明顯增高(P<0.01)，Keap1的蛋白含量逐漸降低，甚至低于對照組(P<0.05)。

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05；**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表達(dá)增高

為了進(jìn)一步分析Nrf2通路激活后肝臟組織中Ⅱ相解毒酶的變化，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法檢測HO1和NQO1的含量。結(jié)果顯示：相對于對照組，濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR促使HO1和NQO1的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，見圖2。

**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

2.4CAT和GSH的活力變化

為了分析Nrf2通路激活后肝臟中抗氧化酶的變化，本實(shí)驗(yàn)檢測CAT和GSH的活力。結(jié)果顯示：與5 mg/kg組相比，濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力減弱(P<0.05)；濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力減弱(P<0.05)，見表2。

3 討論

ATR及其代謝產(chǎn)物于地表水、地下水中經(jīng)?？梢詸z測到[17]，在家中同樣可以檢測到ATR，并且可以追蹤到泥土[18]。在ATR暴露人群的尿液中已經(jīng)檢測出ATR的代謝物[19]。考慮到ATR的生物蓄積作用，ATR的損害應(yīng)引起足夠的重視。最近，在各種動物體內(nèi)進(jìn)行了關(guān)于ATR誘導(dǎo)的氧化損傷的研究，如小鼠、蚯蚓、魚等[10-14]。本實(shí)驗(yàn)通過給小鼠連續(xù)灌胃28天，以等體積的玉米油為對照，實(shí)驗(yàn)組給以濃度為5 mg/kg、25 mg/kg以及125 mg/kg的ATR，第29天腹主動脈取血處死小鼠，觀察小鼠肝臟組織的活性氧水平和Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的含量。

表2 肝臟組織內(nèi)CAT的活力

*：與0 mg/kg組相比，P<0.05；**：與0 mg/kg組相比，P<0.01

當(dāng)自由基生成和來自防御系統(tǒng)的降解失衡時會導(dǎo)致自由基的積累，活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)過高就是自由基積累的典型[20]。當(dāng)ROS產(chǎn)生過多時可以與各種分子如脂類、碳水化合物、蛋白質(zhì)和DNA反應(yīng)，從而改變了它們的結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生細(xì)胞損傷，導(dǎo)致病理過程，包括動脈粥樣硬化、癌癥、關(guān)節(jié)炎等潛在的有害反應(yīng)[1]。丙二醛(Malonaldehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中過氧自由基(ROO·)重排環(huán)化后形成的過氧化作用的最終產(chǎn)物[15]。為印證ATR對小鼠肝臟的氧化損傷，本實(shí)驗(yàn)分析了ATR作用下肝臟組織勻漿的活性氧水平，發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，ATR上調(diào)MDA和NO水平，說明ATR誘導(dǎo)肝臟組織勻漿的活性氧水平提高。

在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，至關(guān)重要的信號通路如Kelch-like ECH-associated protein (Keap1)/NF-E2-related factor 2 (Nrf2)信號通路是針對氧化損傷產(chǎn)生的早期保護(hù)性機(jī)制[15]。生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合，將Nrf2固定于胞漿，Nrf2活性被抑制[21]，修改重塑Keap1的半胱氨酸殘基，如氧化和S-亞硝基化，導(dǎo)致Nrf2易位到細(xì)胞核[6]后，刺激編碼解毒酶和抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，以消除活性氧，保護(hù)細(xì)胞[22]。

因此在發(fā)現(xiàn)ATR作用后肝臟組織活性氧水平增高后，我們進(jìn)一步分析Keap1/Nrf2信號通路的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ATR處理后Nrf2的表達(dá)增高，Keap1的蛋白含量低于對照組。分析原因可能是由于ATR誘導(dǎo)肝臟組織中氧自由基生成過多，促使肝臟組織在ATR的氧化壓力下發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，刺激Nrf2表達(dá)上調(diào)，Keap1的表達(dá)下調(diào)，使更多的Nrf2解離進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)一步激活Nrf2信號通路。

Nrf2進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidative reactive element，ARE)結(jié)合[15]，啟動ARE下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。血紅素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1)和苯醌氧化還原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl)是主要的抗氧化酶之一，用于清除過氧化氫[22]。

本實(shí)驗(yàn)中，在ATR的作用下，HO1和NQO1蛋白含量上調(diào)。較高劑量的ATR將會超出肝臟組織的抗氧化系統(tǒng)的容忍力，機(jī)體抵抗氧化損傷的能力與抗氧化酶的水平和類型相關(guān)[23]。本實(shí)驗(yàn)中，濃度為25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使CAT活力減弱，濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR使GSH活力減弱。在一般情況下，活性氧生成增加時，CAT和GSH含量增高，將過氧化氫分解為水和氧分子[23]，分析可能是ATR所引起的H2O2產(chǎn)生增多，使CAT和GSH消耗高于其他抗氧化酶。相對較高的ATR接觸劑量下，ATR誘導(dǎo)的氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力[24]，當(dāng)然，在相對較高劑量的ATR作用下，肝臟的Ⅱ相解毒酶HO1和NQO1蛋白含量仍是增高的，說明此時肝臟主要依靠Ⅱ相解毒酶的作用抵抗氧化損傷。

綜上，ATR可以誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化應(yīng)激作用，肝臟組織反應(yīng)性提高了Nrf2的表達(dá)，通過Keap1/Nrf2/ARE通路上調(diào)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)。在ATR中劑量組和高劑量組，ATR誘導(dǎo)的氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力，CAT活力減弱，印證了ATR對肝臟的氧化損傷作用。本實(shí)驗(yàn)通過分析ATR作用下肝臟活性氧水平和Nrf2信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)情況，探討了ATR暴露對肝臟的氧化損傷，有助于進(jìn)一步探索ATR對肝臟的損傷機(jī)制。

4 結(jié)論

ATR可以誘導(dǎo)小鼠肝臟氧自由基生成增多，肝臟組織激活Nrf2信號通路，上調(diào)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)。當(dāng)ATR濃度增高，氧化損傷的壓力超出了肝臟抗氧化酶的耐受能力，CAT和GSH活力減弱，印證了ATR對肝臟的氧化損傷作用。