D21S11和Penta D分型異常在21三體綜合征鑒定中的應(yīng)用*

龐潛潛 李長征 王業(yè)全 劉 奇 侯秀迪 崔 文Δ

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，濟(jì)寧 272067)

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)是一類在人類基因組中分布非常廣泛的DNA長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，一般是2～6個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)排列形成。因?yàn)镾TR的核心序列的重復(fù)次數(shù)的不同，使得STR具有極高的多態(tài)性。STR基因座等位基因命名來源就是其核心序列的重復(fù)次數(shù)，遵循孟德爾遺傳規(guī)律，在親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別中應(yīng)用非常廣泛，目前常用于分型的STR基因座多為4核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，個(gè)別位點(diǎn)是5核苷酸重復(fù)。在實(shí)踐中,聯(lián)合使用多個(gè)STR可以產(chǎn)生數(shù)億的基因型組合，而每一種組合在群體中出現(xiàn)的頻率都非常低，可以在很高的概率水平上認(rèn)定嫌疑人。因此，STR基因座的PCR分型目前是國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)親緣鑒定和個(gè)體識(shí)別最主要的技術(shù)。歐盟法醫(yī)DNA 分型標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)認(rèn)為，雖然近些年新的技術(shù)與新的遺傳標(biāo)記在不斷地涌現(xiàn),但在今后相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)，STR 將仍然是法醫(yī)學(xué)應(yīng)用最主要的遺傳標(biāo)記[1]。

唐氏綜合征(Down syndrome,DS)即21三體綜合征，又稱為先天愚型，是最常見的染色體數(shù)量異常疾病之一，表現(xiàn)為嚴(yán)重智力低下及發(fā)育異常，新生兒發(fā)病率約1/600～1/800[2]，患兒在出生時(shí)即表現(xiàn)出特殊面容。唐氏綜合征主要是卵子減數(shù)分裂時(shí) 21 號(hào)染色體不分離，形成異常卵子導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙引起的[3]。目前正常孕檢項(xiàng)目已包括唐氏篩查項(xiàng)目，并且唐篩高危人群可以選擇羊水穿刺或者無創(chuàng)DNA技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)胎兒染色體數(shù)目是否正常。D21S11和Penta D是位于21號(hào)常染色體上的兩個(gè)距離較近的STR基因座，相距大約25Mb，D21S11是一個(gè)四核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，Penta D是一個(gè)五核苷酸重復(fù)的STR位點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)21三體綜合征鑒定中具有重要應(yīng)用價(jià)值[4-6]。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

受檢樣本來自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室受理的親權(quán)鑒定案件。樣品采集時(shí)間為2018年4月10日，樣品為血樣，F(xiàn)TA卡采集，室溫存放。具體案情為：被檢母親妊娠期唐氏篩查檢測結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)，但是考慮到被檢母親為高齡產(chǎn)婦(38歲)，增加了無創(chuàng)DNA檢測項(xiàng)目進(jìn)行確定。無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果未顯示有21三體綜合征等遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)，被檢母親生產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)新生兒出現(xiàn)21三體綜合征患兒的特殊面容，因此需進(jìn)行DNA檢測以確定新生兒是否為21三體綜合征患兒。被檢母親現(xiàn)場抽血(以下稱為被檢母親)并提供了自稱為新生兒的血樣檢材(以下稱為血樣檢材)。

1.2 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀(AB公司，美國)；ABI-3500遺傳分析儀(AB公司，美國)；GeneMapper ID-X 1.4軟件(AB公司，美國)；Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒(基點(diǎn)認(rèn)知公司，中國)；華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒(AB公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒檢測 用Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒復(fù)合擴(kuò)增Amelogenin基因座和19個(gè)STR基因座(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1P0，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX，Penta E，TH01，D12S391，D2S1338，F(xiàn)GA)。使用ABI 9700(金座)熱循環(huán)儀，反應(yīng)體系為10μl，含 H2O 3.84μl、PCR Reaction Mix 4.0μl、引物2.0μl、FTA卡打孔0.5mm、 Gold Taq 酶(5U/μl)0.16μl。PCR反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性2min；94℃ 5s，60℃ 70s，共27個(gè)循環(huán)后；60℃延伸30min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒檢測 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒復(fù)合擴(kuò)增Amelogenin基因座和22個(gè)STR基因座(D19S433，D5S818，D21S11，D18S51，D6S1043，D3S1358，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1P0，Penta D，vWA，D8S1179，TPOX，Penta E，TH01，D12S391，D2S1338，F(xiàn)GA，D22S1045，D10S1248，D1S1656)。使用ABI 9700(金座)熱循環(huán)儀，反應(yīng)體系為10μl，含 PCR Reaction Mix 4.0μl、引物4.0μl、Prep-n-go 2.0μl，F(xiàn)TA卡打孔0.5mm。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1min；94℃ 3s，59℃ 16s，65℃ 29s，共27個(gè)循環(huán)后；60℃延伸5min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3結(jié)果判定 用ABI 3500分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，通過GeneMapper ID -X 1.4 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。檢測結(jié)果通過計(jì)算親權(quán)指數(shù)(paternity index,PI)、累積親權(quán)指數(shù)(cumulative paternity index,CPI)， 遵循孟德爾遺傳定律判定血樣檢材與被檢母親是否親生關(guān)系。STR基因座出現(xiàn)3個(gè)等位基因熒光峰，峰值面積比值為1∶1∶1 時(shí)，或者出現(xiàn)兩個(gè)等位基因熒光峰，峰值面積比為2∶1或1∶2 (或出現(xiàn)峰值面積未達(dá)到2∶1/1∶2，但<0.65或者>1.8)時(shí)，或者出現(xiàn)1 個(gè)峰且峰面積是相鄰雜合子單峰峰面積3倍時(shí)，制定為三等位基因。

2 結(jié)果

2.1 Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒的STR分型及鑒定結(jié)果

對被檢母親現(xiàn)場抽取的血樣及其提供的血樣檢材進(jìn)行常規(guī)親子鑒定所用的Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后STR分型。見表1。

血樣檢材STR分型結(jié)果顯示：該血樣檢材包括D19S433在內(nèi)的19個(gè)常染色體STR基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源。但是D21S11和Penta D這兩個(gè)基因座的STR分型出現(xiàn)異常，均出現(xiàn)了3個(gè)峰，為三等位基因(圖1)。被檢母親的D21S11和Penta D這兩個(gè)基因座的等位基因分型正常(圖1)。通過與相應(yīng)的Cadder進(jìn)行比較結(jié)果顯示(圖2、圖3)：D21S11和Penta D兩個(gè)基因座出現(xiàn)的3個(gè)等位基因峰沒有顯著差別，與Cadder的峰位置能夠完全對應(yīng)，并且與被檢母親對應(yīng)的峰位置相同，這就說明這兩個(gè)位點(diǎn)的STR分型結(jié)果能夠確定為三等位基因。

表1 Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒基因座分型結(jié)果

圖1 被檢母親和血樣檢材的Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒STR分型結(jié)果

圖2 Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒D21S11基因座比對結(jié)果

圖3 Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒Penta D基因座比對結(jié)果

2.2 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒的STR分型及鑒定結(jié)果

為了確認(rèn)Goldeneye 20A的STR得到的三等位基因的分型結(jié)果，被檢母親及血樣檢材通過華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增后STR分型結(jié)果見表2。

血樣檢材STR分型結(jié)果顯示：該血樣檢材包括D3S1358在內(nèi)的23個(gè)常染色體STR基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源，與Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒分型結(jié)果一致的是D21S11和Penta D這兩個(gè)基因座的STR分型依然是存在3個(gè)等位基因峰(圖4)。通過與相應(yīng)的Cadder進(jìn)行比較，結(jié)果也可以明顯看出：D21S11和Penta D兩個(gè)基因座出現(xiàn)的三個(gè)等位基因峰沒有顯著差別，峰的位置與Cadder能夠?qū)?yīng)，并且與被檢母親的對應(yīng)峰位置也相同，再一次說明這兩個(gè)位點(diǎn)的STR分型結(jié)果為三等位基因。見圖5、6。

表2 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒基因座分型結(jié)果

圖4 被檢母親和血樣檢材的華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒STR分型結(jié)果

圖5 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒D21S11基因座比對結(jié)果

圖6 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒Penta D基因座比對結(jié)果

3 討論

在本案件親權(quán)關(guān)系鑒定過程中，被檢母親及其提供的新生兒血樣(血樣檢材)通過Goldeneye 20A PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，STR分析的結(jié)果顯示：血樣檢材各個(gè)基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源，符合孟德爾遺傳定律。

但是血樣檢材中的D21S11(28/29/30)和Penta D(12/13/14)這兩個(gè)基因座的STR分型均出現(xiàn)了3個(gè)等位基因，并且D21S11和Penta D都位于第21號(hào)染色體。為了確認(rèn)該結(jié)果，排除實(shí)驗(yàn)過程中操作引起分型異常，我們進(jìn)一步用華夏白金試劑盒PCR擴(kuò)增分型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：血樣檢材中D21S11和Penta D這兩個(gè)基因座的STR分型依然出現(xiàn)了3個(gè)等位基因，除此之外的其他染色體上的位點(diǎn)STR分型均是正常的二等位基因，以此可以推斷該血樣檢材來自21三體綜合征患者。經(jīng)過案情回訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該新生兒已經(jīng)進(jìn)行了染色體檢查，共檢測了50個(gè)核型，其中48個(gè)核型存在三條21號(hào)染色體(見圖7)，這就進(jìn)一步確證了該新生兒是21三體綜合征患者。

圖7 核型診斷結(jié)果

STR分型結(jié)果顯示被檢母親的19個(gè)STR位點(diǎn)分型是正常的，另據(jù)被檢母親敘述，該新生兒父親也沒有21三體綜合征的相關(guān)表現(xiàn)。一般情況下，來源于父親減數(shù)分裂失敗的染色體三體十分少見[7]，這說明了該新生兒的3條21號(hào)染色體可能是由于減數(shù)分裂時(shí)的21號(hào)染色單體分離失敗導(dǎo)致的。由于并不能確認(rèn)該新生兒的第3條21號(hào)染色體的來源，因此累計(jì)親權(quán)指數(shù)的計(jì)算較為復(fù)雜，需多加注意[8]。

在親權(quán)鑒定中，有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)某一基因座有3個(gè)帶型或者3個(gè)等位基因分型的STR結(jié)果，這一現(xiàn)象可能是由于拷貝數(shù)變化、染色體數(shù)目異常(18染色體三體，21染色體三體等)或者是引物的結(jié)合區(qū)發(fā)生突變導(dǎo)致的[9]，因此需要多個(gè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，并對多個(gè)試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，排除干擾因素，確認(rèn)該STR分型結(jié)果。三帶型基因座的三個(gè)峰高可能相同也可能不同，21三體樣本檢驗(yàn)中除出現(xiàn)3條帶外，還可能出現(xiàn)2條或1條帶[10]。出現(xiàn)3條帶判型較易判別，而當(dāng)出現(xiàn)2個(gè)峰，但峰面積之比為2∶1或出現(xiàn)1個(gè)峰且峰面積是相鄰雜合子單峰峰面積3倍時(shí)，應(yīng)注意排除本癥。本文通過多位點(diǎn)STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)的兩種試劑盒相互驗(yàn)證，確定21號(hào)染色體上的兩個(gè)基因座D21S11和Penta D確實(shí)為三等位基因，并且結(jié)合已有的染色體核型檢測結(jié)果確定該血樣來自21三體綜合征患者。

在親權(quán)關(guān)系鑒定或個(gè)體識(shí)別過程中，如果出現(xiàn)三等位基因現(xiàn)象一定要非常重視，需要使用不同的擴(kuò)增試劑盒和重復(fù)檢測驗(yàn)證分型結(jié)果[11-12]，以排除污染和泳道滲漏等導(dǎo)致誤判的問題。