HPLC測定不同采收期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量

★ 楊元豐 劉鑫 譚舒舒 楊武亮

(江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004)

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實。其性味甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)。具有滋補肝腎、明目烏發(fā)的功效[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列之為上品，謂其“味苦平，主補中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病”[2]。女貞子中主要含有萜類[3]、黃酮類[4]、苯乙醇類、多糖[5]等化學成分。近代藥理研究表明女貞子具有抗炎、降血糖、保肝、抗衰老、抗癌及抗腫瘤等作用，并能提高免疫功能[6]。其中齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursohc acid，UA)是女貞子中主要脂溶性成分，兩者屬五環(huán)三萜類化合物，結構極為相似。

齊墩果酸毒性很低，具有多種生物活性：抗病毒、消炎、增強免疫和免疫調(diào)解、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、保肝、護腎、抗艾滋病毒等作用[7-9]熊果酸毒性小，具有多種生物學活性，尤其是在抗腫瘤、抗氧化、保肝、降血脂方面作用顯著[10-12]。表明齊墩果酸和熊果酸是為女貞子的活性成分。2015年版《中國藥典》規(guī)定女貞子在冬季果實成熟時采收，又因女貞分布地域廣，各地果實成熟時間差異較大，其活性成分含量是否因女貞子采收期不同而受到影響。清代·汪昂的《醫(yī)方集解》(刊于1682年)在對“二至丸”的制法記載中，對女貞子采集時間的要求“冬青子(即女貞子) 冬至日采……旱蓮草夏至日采”[13]。是否女貞子應在冬至前后采收，未見文章報道。本文建立同時測定齊墩果酸和熊果酸含量的高效液相色譜方法，并對江西省南昌市灣里區(qū)江西中醫(yī)藥大學校園內(nèi)不同采收時期的女貞子進行含量測定，研究兩種萜類成分含量的動態(tài)變化，為指導當?shù)嘏懽拥牟墒掌诩捌鋺锰峁┛茖W依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(自動進樣器：G1329B;四元泵：G1311C；柱溫箱：G1316A；DAD檢測器：G4212B；Agilent色譜工作站)。萬分之一天平(德國，Sartorius BT224s)；十萬分之一天平(德國，Sartorius BT25s)；色譜柱：Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)。

齊墩果酸(批號：110709-201206)，熊果酸(批號：110742-201421)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。乙腈(HPLC級，美國Tedia公司)；其它試劑均為分析純，水為雙蒸水。

女貞子藥材于冬至前后采于江西南昌灣里區(qū)江西中醫(yī)藥大學校園內(nèi)(共12批，編號1～12)的同一棵女貞樹，每隔1星期采集一次，采集時間見表7，并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥用植物學科組賴學文副教授鑒定為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的果實。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 分別取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，精密稱定，分別置25mL容量瓶中，加甲醇定容，得到每1mL分別含0.3536mg齊墩果酸與0.3440mg熊果酸的溶液，搖勻，即得齊墩果酸和熊果酸對照品各自的貯備液，備用。

2.2 供試品溶液的制備 取女貞子干燥粉末(過三號篩)約1.0g，精密稱定，加甲醇50mL，稱重，水浴加熱回流60min，放置室溫，再稱重，用甲醇補足減失的量，搖勻，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱 Dikma Diamonsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17；流速:1mL/min，進樣量：10μL，檢測波長：205nm；柱溫：30℃。色譜圖見圖1。

A：混合對照品；B：樣品；C：甲醇溶劑；1.齊墩果酸；2.熊果酸

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取上述齊墩果酸對照品貯備液7.5mL、熊果酸對照品貯備液2.5mL，同置于10mL容量瓶中，得到分別含0.2652mg/mL的齊墩果酸和0.086mg/mL熊果酸的混合對照品溶液。采用自動進樣方法，精密吸取2，4，6，8，10，12，14μL進樣，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。齊墩果酸、熊果酸的回歸方程分別為:Y=530.01X-16.28(r=0.9993)和Y=520.111X+2.4739(r=0.9990)，表明齊墩果酸、熊果酸分別在0.5304～3.7128μg 和0.1720～1.2040μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10μL，按上述色譜條件，重復進樣6次，測得齊墩果酸、熊果酸峰面積RSD值分別為1.47%和1.77%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(女貞子6號，含齊墩果酸1.88%，熊果酸0.18%)，分別于0，2，4，6，8，10，12h后進樣，測得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為0.42%和1.75%，結果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一樣品6份(女貞子6號)，按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，進樣，測得齊墩果酸和熊果酸含量，計算其RSD，分別為0.20%和1.43%，結果表明方法的重復性好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的女貞子樣品(女貞子6號)6份，每份0.5g，加入一定量齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按2.2項制備方法制備，測定齊墩果酸和熊果酸的含量，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品含量測定 取不同采收期干燥至恒重的女貞子(過三號篩)樣品1.0g，按2.2項下方法制成供試品溶液，在2.3項色譜條件下，測量峰面積并用外標法計算樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量，樣品含量測定結果見表2。

表2 不同采收期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長確定 齊墩果酸和熊果酸的全波長UV圖發(fā)現(xiàn)其在紫外末端有吸收，本實驗選取205nm為齊墩果酸和熊果酸檢測波長。

3.2 流動相的優(yōu)化 本實驗參考文獻[14-15]，對齊墩果酸和熊果酸分離用流動相配比進行優(yōu)化，最后以乙腈∶甲醇∶水(1000mL含2mL磷酸和4mL三乙胺)=50∶33∶17，兩者分離度大于1。

3.3 檢測池的選用 本實驗采用Agilent可變波長檢測器(VWD)和二極管陣列檢測器(DAD)，分別進樣同濃度、同體積的齊墩果酸和熊果酸混合對照品溶液，測定其峰面積，比較測定結果。結果顯示采用VWD檢測器測得的峰高和峰面積較DAD檢測器均低，其原因在于：VWD檢測器的檢測池體積有10μL，而DAD檢測器的檢測池的體積只有1μL，本實驗采用后者檢測器。

3.4 女貞子采收時期的確定 表2中不同采收期女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量測定結果，表明江西南昌市灣里區(qū)在上述采收期內(nèi)的女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量變化不大，并非在冬至前后會較高，故推斷兩成分與“女貞子在冬至前后采收”無關。

為此本文采用HPLC-FP[16]方法對上述不同采收期的女貞子中的紅景天苷和特女貞苷含量進行了測定，以進一步判斷上述兩成分是否會受到女貞子采收時期影響。結果見圖2。

圖2 不同采收期女貞子中特女貞苷和紅景天苷含量變化趨勢圖

上述結果表明：女貞子中特女貞苷和紅景天苷的含量與“女貞子在冬至后采收”無關。女貞子在中醫(yī)臨床用于滋補肝腎、明目烏發(fā)，屬于補益類藥物，其最佳采收期是否與其多糖等成分相關，仍有待下一步考察。