一株產(chǎn)靈菌紅素粘質(zhì)沙雷氏菌株培養(yǎng)條件探索

蔡麗娜　付陳增

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）10-0-01

靈菌紅素（prodigiosins，PG）是一類天然紅色素的總稱，通常都有3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)，是由多種放線菌、沙雷氏菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。根據(jù)其側(cè)鏈基團結(jié)構(gòu)的不同，可分為靈菌紅素、間環(huán)丙菌素、十一烷基靈菌紅素、壬烷基靈菌紅素和環(huán)丙烷靈菌紅素等系列結(jié)構(gòu)類似物（圖1）。靈菌紅素呈暗紅色，綠色反光，熔點151～152℃，屬于脂溶性色素，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO，幾乎不溶于水[2]。靈菌紅素對光不穩(wěn)定，需要避光保存[2]。靈菌紅素受pH 值的影響較大，在酸性環(huán)境中能保存較長的時間，在堿性條件下則不穩(wěn)定。近年來研究顯示PG具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫抑制和抗腫瘤等多種活性。

一、材料與儀器

1.菌種

本實驗室自有產(chǎn)靈菌紅素的S. Marcescens y2菌株（y2+），經(jīng)篩選純化獲得不產(chǎn)色素突變菌株（y2-），以y2-菌株作為對照，減少色素對菌體本身的作用，來檢測外界環(huán)境因子對粘質(zhì)沙雷氏菌生長繁殖的影響。

2.培養(yǎng)基

前期研究發(fā)現(xiàn)，分別采用LB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA及SN培養(yǎng)基（蔗糖20g/L、牛肉膏18g/L、CaCl21.1g/L）培養(yǎng)S. Marcescens y2菌株，28℃、200rpm條件下SN培養(yǎng)基可以獲得較高產(chǎn)量的靈菌紅素，且菌量較多。

3.試劑與儀器

722可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），Varian cary 100型紫外可見分光光度計（Agilent Technologies），TGL 16G臺式低溫高速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠），Thermo MK3酶標儀。

二、實驗方法

1.細菌培養(yǎng)

從平板上挑取單菌落至30mlSN液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.1，再分別以100μl新鮮菌液接種到30mlSN液體培養(yǎng)基中28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)48h，用以觀察鑒定。

2.細菌生長量及靈菌紅素產(chǎn)量測定

將菌液稀釋十倍后取200μl至96孔板中，用酶標儀在630nm波長下檢測吸光值OD630nm來表示菌的生長量。分別取1ml菌液至1.5mlEP管中，8000rpm、10min離心取上清，用pH=2.5的酸性甲醇溶液稀釋2倍后，用紫外可見光光度計掃描檢測，在535nm波長下有最大吸收峰，以O(shè)D535nm表征胞外色素產(chǎn)量；將沉淀用1ml、pH=2.5的酸性甲醇溶液振蕩混勻，放置30min，提取胞內(nèi)色素，適當稀釋后，檢測方法同胞外色素，以535nm處吸收峰峰值表征胞內(nèi)色素產(chǎn)量。

三、結(jié)果與分析

1.生長曲線測定

28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)y2+、y2-，分別在0、2、4、8、12、24、30、36、48、60、72、96取新鮮菌液200μl至96孔板，設(shè)置3個重復，酶標儀檢測OD630nm，獲得生長曲線如下圖Fig.1所示。結(jié)果顯示y2+菌株比y2-提前進入指數(shù)生長期，但都在36h時進入穩(wěn)定期，可見產(chǎn)色素菌株為次級代謝產(chǎn)物靈菌紅素的生產(chǎn)而適當延長指數(shù)生長期，靈菌紅素代謝過程可能與細菌生長周期相關(guān)蛋白的調(diào)控相關(guān)。

2.靈菌紅素光譜掃描鑒定

光譜掃描圖清晰顯示，在pH2.5的甲醇溶液中，靈菌紅素在535nm處有最大吸收峰。

四、討論

色素的產(chǎn)生是微生物在長期進化過程中為了適應(yīng)環(huán)境的改變而形成的代謝產(chǎn)物，與其產(chǎn)生菌的生存能力及對環(huán)境的適應(yīng)能力有著很重要的作用和意義。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素是部分放線菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弧菌及假單胞菌等細菌的次級代謝產(chǎn)物，具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、抗腫瘤及免疫抑制能多種生物活性，對多種抗腫瘤藥、抗菌藥、免疫抑制劑的開發(fā)都用著較高的應(yīng)用前景。但是靈菌紅素對其產(chǎn)生菌本身的作用研究甚少，研究二者的相互關(guān)系對靈菌紅素的生產(chǎn)及應(yīng)用都有著重要的意義。本研究以篩選得到不產(chǎn)色素的突變菌株y2-作為細菌生長情況的對照，排除色素的干擾作用，通過改變外界環(huán)境因素來檢測粘質(zhì)沙雷氏菌y2+菌株的生長量及色素產(chǎn)量，從而揭示粘質(zhì)沙雷氏菌的生長繁殖和靈菌紅素的生產(chǎn)與環(huán)境因素之間的相互作用、相互影響。

從天然藥物中提取純化化合物，并篩選出具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，或者以天然產(chǎn)物作為先導化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，合成其衍生物看是否具有抗腫瘤活性，進而開發(fā)出臨床有效的抗腫瘤藥物，一直是抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域追求的目標之一。由于靈菌紅素的“細胞毒性"目前作為免疫抑制藥物仍然受到限制。但以靈菌紅素化合物作為基本骨架結(jié)構(gòu)，尋找免疫抑制活性強、毒副作用低的衍生物有較好的前景因而備受關(guān)注。目前靈菌紅素通常是以沙雷菌為生產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵制備并提純其代謝產(chǎn)物而獲得。由于制備過程的原因，難以大量生產(chǎn)，影響對其的進一步研究。

參考文獻

[1]王飛，羅海瀾， 劉暢， 王建國， 李林珂， 等. 一株粘質(zhì)沙雷氏菌的分離和產(chǎn)紅色素初步研究. 食品工業(yè)，2011，174： 53-55.

[2]王飛，羅海瀾， 周銀芳， 李囡囡， 劉素， 等. 不同光照、氮源對Serratia marcescens y2生長及色素產(chǎn)量的影響. 食品科學，2012，33： 234-240.