多核銅槲皮素配合物的制備及抗腫瘤活性測(cè)試

王繼群，張 雷，劉麗敏，張雨晴，艾莉蒳，李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

槲皮素(quercetin，Que,5,7,3',4'-五羥基黃酮)具有廣泛的藥理活性，如降血壓、降血脂、抗炎、抗腫瘤等[1-6]。由于其溶解性差，限制了該藥品的應(yīng)用。槲皮素對(duì)金屬離子具有較強(qiáng)的配位性，可以與多種金屬離子配位，生成配合物溶解性較好，同時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性[9-15]。因此關(guān)于槲皮素金屬配合物的研究逐漸增多，對(duì)于金屬配合物的抗腫瘤活性研究是其中的熱門課題[8-12]。

槲皮素銅配合物的研究得到密切關(guān)注[10,12]。在已報(bào)道的槲皮素銅配合物的合成中，槲皮素與金屬的配比為2∶1，即兩分子槲皮素的3-OH、4-CO與銅配位；或者配比為1∶2，即槲皮素3'-OH、4'-OH與銅配位，同時(shí)3-OH、4-CO與銅配位。

新戊酸銅由雙核銅和四個(gè)新戊酸根組成的配合物，新戊酸根具有很強(qiáng)的配位性能。本實(shí)驗(yàn)使用新戊酸銅為原料與槲皮素反應(yīng)，制備不同組成的配合物。用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep3B的抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與藥品

紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀由KBr壓片法測(cè)定。紫外光譜在thermo scientific紫外分光光度計(jì)上測(cè)定。元素分析在Vario Micro cube上測(cè)定。差熱分析在Mettler Toledo TGA/SDTA851e上測(cè)定。酶標(biāo)儀使用Bio-Tek公司酶標(biāo)儀。

槲皮素(上海麥克林)；DMEM高糖(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(Solarbio公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；青鏈霉素(Solarbio公司)；臺(tái)盼藍(lán)(Sigma公司)；MTT(Macklin公司)；人肝癌細(xì)胞(Hep3B)取自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。

1.2 配合物的合成

1.2.1 配合物1(槲皮素:銅 = 2:1)

槲皮素(1.208 g，4 mmol)，無(wú)水乙醇(50 mL)，在100℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入新戊酸銅(0.532 g，1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產(chǎn)物，產(chǎn)量1.083 g。元素分析：實(shí)際值C: 47.22%，H:3.67%；理論值C: 47.66%，H:3.73%。IR(KBr,cm-1)：3480～3272 b,1650 s，1599 s,1508 s,1432 w,1369 w,1321 w,1271 s,1208 w,1098 w,1016 w,824 w,625 w。

1.2.2 配合物2(槲皮素∶銅 = 1∶1)

槲皮素(0.604 g，2 mmol)，無(wú)水乙醇(50 mL)，在100℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入新戊酸銅(0.532 g，1 mmol)，攪拌回流1 h，抽濾后得黑色產(chǎn)物，產(chǎn)量0.947 g。元素分析：實(shí)際值C: 44.39%，H: 3.88%；理論值C: 44.83%，H: 4.08%。IR(KBr,cm-1)：3510～3315 b,2967 w,1640 m,1597 s,1536 m,1484 s,1415 w,1357 m,1320 m,1268 s,1201 w,1094 w,813 w,624 w。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞(Hep3B)置于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4 槲皮素銅配合物的體外抗癌活性測(cè)試

1.4.1 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)期Hep3B細(xì)胞接種于96孔板，每孔150 μL，細(xì)胞數(shù)約為8000個(gè)，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞貼壁并恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)。配合物1和2用DMSO溶解至200 μg/mL，取1 μL加入到細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep3B細(xì)胞接種于96孔板上，每孔液體150 μL，細(xì)胞數(shù)約為10000個(gè)，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h至細(xì)胞完全貼壁后加藥。用DMSO將配合物1、2、槲皮素、新戊酸銅稀釋至濃度為250.00、200.00、125.00、62.50、31.25、15.63、3.91 μg/mL，每孔滴加藥物1 μL，另設(shè)溶劑對(duì)照組(DMSO)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加10 μL濃度為5 mg/mL 的MTT，置于37℃、5%CO2條件下再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移去上清液，每孔加入DMSO(150 μL)，振蕩5 min，利用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制成細(xì)胞存活率曲線圖，用SPSS計(jì)算細(xì)胞毒性IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素銅配合物組成及結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 紅外解析

槲皮素、新戊酸銅與配合物1、2用紅外光譜表征，主要譜峰與官能團(tuán)分析如表1。

表1 各化合物官能團(tuán)與吸收峰對(duì)照表

配合物1、2中未見雙酚結(jié)構(gòu)吸收峰，說(shuō)明3'-OH、4'-OH參與配位。在624 cm-1或625 cm-1處都含有配位水分子振動(dòng)峰。配合物2中有新戊酸根C-H振動(dòng)峰。配合物1、2中，槲皮素C=O振動(dòng)位移變換較小，表明未參與配位。

2.1.2 紫外光譜解析

槲皮素、配合物1和2用紫外光譜進(jìn)行表征。待測(cè)樣品用甲醇溶解，在200～600 nm范圍檢測(cè)紫外吸收。槲皮素在甲醇中的紫外吸收光譜中有兩個(gè)吸收帶，帶I由B環(huán)電子π-π*躍遷吸收引起的，在375 nm處；帶II由A環(huán)π-π*躍遷吸收引起的，在260 nm處。在金屬配合物1和2中，帶I紅移，在440 nm處，說(shuō)明B環(huán)3'-OH和4'-OH參與配位。帶II幾乎未變，說(shuō)明A環(huán)未參與配位。

2.1.3 元素分析與熱重分析

元素分析配合物1實(shí)際值C: 47.22%，H: 3.67%；配合物2實(shí)際值C: 44.39%，H: 3.88%；差熱熱重實(shí)驗(yàn)顯示，配合物在200℃以下均有質(zhì)量減少，說(shuō)明分子內(nèi)含有結(jié)晶水或配位水。

綜合多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出配合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。配合物1的結(jié)構(gòu)式與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]相同。配合物2的結(jié)構(gòu)推測(cè)為2分子槲皮素與2分子Cu配位，1分子新戊酸根和兩分子水參與配位。在此種結(jié)構(gòu)組成中，配合物1和2的元素分析的實(shí)際值與理論值較為一致。

圖1 配合物分子結(jié)構(gòu)

2.2 配合物1、2對(duì)Hep3B細(xì)胞形態(tài)的影響

A：配合物1(200.00 μg/mL)；B：配合物2(200.00 μg/mL)；C：空白對(duì)照。圖2 槲皮素銅配合物作用24 h、48 h后，倒置顯微鏡下 Hep3B的細(xì)胞形態(tài)

實(shí)驗(yàn)采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。圖2為配合物1和2在藥物濃度為200.00 μg/mL時(shí)，作用24 h、48 h后，肝癌細(xì)胞Hep3B的細(xì)胞形態(tài)。空白對(duì)照組細(xì)胞大小均一，胞質(zhì)顏色透明。藥物處置細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞變圓浮起反差增大，細(xì)胞間接觸變松，胞質(zhì)中顆粒增多。死細(xì)胞的數(shù)量增多，細(xì)胞完整性受到破壞，形成大量細(xì)胞碎片。

2.3 配合物1、2對(duì)Hep3B的細(xì)胞毒性

槲皮素金屬配合物通常具有較槲皮素強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用。實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)槲皮素銅配合物1、2、槲皮素、新戊酸銅對(duì)Hep3B的細(xì)胞毒性。在加藥24 h、48 h后，不同藥物對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B造成了不同程度的抑制作用，如圖3所示。槲皮素的溶解度較差，在研究對(duì)細(xì)胞的抑制作用時(shí)只能檢測(cè)到62.50 μg/mL，在此濃度下，細(xì)胞抑制率達(dá)到45.78%。新戊酸銅表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞抑制作用，IC50值為60.50 μg/mL。配合物1在作用24 h后表現(xiàn)的抑制作用有限，在濃度為200.00 μg/mL時(shí)，最大抑制率達(dá)到38%，濃度升高，抑制率沒有增長(zhǎng)。在作用48 h后表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，IC50值為90.39 μg/mL。配合物2具有較強(qiáng)的抑制效果，在作用24 h和48 h的IC50值分別為125.96 μg/mL和78.08 μg/mL。配合物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制均呈劑量依賴，即隨藥物濃度的增加細(xì)胞的抑制效果增強(qiáng)。在給藥時(shí)間為24～48 h時(shí)，抑制率隨著作用時(shí)間的增強(qiáng)而增強(qiáng)，呈正相關(guān)。

A：24 h，B：48 h圖3 配合物及對(duì)照藥品對(duì)Hep3B的抑制率曲線

3 結(jié)論

本文采用摩爾配比法合成槲皮素與銅的配合物。實(shí)驗(yàn)以新戊酸銅為原料利用新戊酸根的強(qiáng)配位性，獲得新型多核配合物。配合物2中新戊酸根橋連兩個(gè)銅原子形成雙核槲皮素銅配合物，其特殊結(jié)構(gòu)使配合物2表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞抑制作用，在48 h時(shí)IC50值為78.08 μg/mL。