不同發(fā)酵度茶葉提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響

李艷暉，劉妙玲，呂思慧，蘇晗濤，孫海燕

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且具有相當(dāng)高的致死率?！?014年世界癌癥報(bào)告》表明，在所有癌癥中結(jié)直腸癌的全球病發(fā)率居第3位［1］。而富含飽和脂肪酸的飲食結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致結(jié)直腸癌的重要因素之一［2］。目前臨床針對(duì)結(jié)直腸癌的治療多以手術(shù)和傳統(tǒng)化學(xué)合成藥物為主的綜合治療，盡管治療手段取得一定突破，但治療后患者生存率仍較低，且治療藥物存在副作用大、非特異性強(qiáng)、耐藥等問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)作用于特定靶點(diǎn)的高效、低毒、特異性強(qiáng)的新型抗結(jié)直腸癌藥物是目前藥物研究發(fā)展的重要方向。已有研究發(fā)現(xiàn)，在天然植物的提取成分中發(fā)現(xiàn)了酚酸等物質(zhì)能阻止結(jié)直腸癌的前驅(qū)病變異常隱窩灶的形成［3］。茶葉作為一種天然植物，在世界各地人民的飲食習(xí)慣中十分普遍，其抗癌作用也受到人們的關(guān)注。

茶多酚是茶葉浸出物中含量高的抗氧化物質(zhì)。細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)研究均表明，茶多酚能夠有效降低腫瘤發(fā)生率、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［4-8］。但茶多酚是否具有抗結(jié)直腸癌作用目前尚無(wú)定論。另外，人們按茶葉加工發(fā)酵的方式與程度劃分成不發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、全發(fā)酵茶，不同發(fā)酵程度茶浸提液主要功能性成分含量差異較大［9］，且有研究表明不同加工形式茶葉中茶多酚等功能性成分含量和抗氧化活性有相關(guān)性［9-10］。但有關(guān)不同發(fā)酵程度茶葉中茶多酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞作用方面的研究目前尚無(wú)報(bào)道。為研究不同發(fā)酵程度茶葉中茶多酚提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，本研究采用未發(fā)酵茶（黃山毛峰）、半發(fā)酵茶（大紅袍）、全發(fā)酵茶（祁門(mén)紅茶），探究不同發(fā)酵程度茶葉中的茶多酚提取物對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖的影響，以期拓寬茶葉用途、為其作為天然藥物治療癌癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116由廣東省胃腸病學(xué)研究所（廣東省結(jié)直腸盆底疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）劉煥亮教授課題組贈(zèng)送；黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶（屬二級(jí)茶葉，分別烘干、打粉、過(guò)孔徑0.18 mm篩，自封袋封好放干燥器中避光備用。

供試藥劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin雙抗、澳洲特級(jí)胎牛血清（FBS）、0.05%Trypsin-EDTA（1X）（美國(guó)GIBCO公司），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司），MTS（Promega公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備包括：HERAcell240型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），多功能酶標(biāo)儀SpectraMax? M5e（ 美 國(guó) Molecular Devices），LeicaDMIRB倒置生物熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），5430-R低溫高速離心機(jī)、5810-R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），SWCJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司），全自動(dòng)手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器Scepter?、細(xì)胞計(jì)數(shù)芯片 Scepter? Sensors-60μm（美國(guó)Millipore公司），25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96-well細(xì)胞培養(yǎng)板（透明）、15 mL離心管、50 mL離心管、0.45 μm濾膜、1.5 mL EP離心管（美國(guó)Corning Costar公司），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），EPED-E2-20TS型實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 從液氮罐中取出冷凍管，迅速放進(jìn)37℃水浴溶解，然后在無(wú)菌條件下將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP離心管，600 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清和1%雙抗，下同）重懸細(xì)胞，加入4～5 mL RPMI-1640培養(yǎng)液和1 mL重懸細(xì)胞液于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2恒溫箱靜置培養(yǎng)。

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116，體外培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%,胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

12.2 茶多酚提取方法 取20 g已處理的茶葉粉末，加入500 mL 70%甲醇，冷凝回流浸提30 min（重復(fù)浸提3次），合并濾液，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的15%～20%，然后用3倍體積氯仿萃取1次，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至萃取后體積的5%左右，剩余部分溶解于超純水中。15 000 r/min離心20 min，取上清液，真空冷凍干燥，常溫避光保存。

1.2.3 茶多酚提取物總多酚含量測(cè)定 總多酚含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法［11］，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。分別精確稱取所提取的黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶茶多酚粗粉適量，定容至合適體積。取100 μL樣品（可作適當(dāng)稀釋）和400 μL超純水，加入0.1 mL福林酚試劑混勻后，靜置6 min。根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算待檢樣品中酚類物質(zhì)的含量，茶多酚含量以每克茶多酚粗粉中所含的沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg /g，DW）表示。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.2.4 HCT116細(xì)胞存活率測(cè)定 采用MTS還原反應(yīng)測(cè)定HCT116細(xì)胞的存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116胰酶消化后，人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116培養(yǎng)液重懸，取2.5×105個(gè)細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，以100 μL/孔接種于96孔板孔內(nèi)。各處理分別加入5、15、25、35 μg/mL濃度梯度的3種茶多酚于HCT116細(xì)胞中，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)；空白對(duì)照（無(wú)接種細(xì)胞）、對(duì)照（有接種細(xì)胞）各加入不含茶多酚的等體積無(wú)血清無(wú)雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后避光，每孔各加入10 μL MTS孵育，4 h后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸收度（A）值，計(jì)算抑制率并用Graphpad Prism 5.0軟件計(jì)算藥物處理細(xì)胞后達(dá)半數(shù)抑制的藥物濃度IC50。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將對(duì)照及藥物處理72 h后的細(xì)胞置于LeicaDMIRB倒置生物熒光顯微鏡的10倍光學(xué)顯微鏡下，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和比較。選取對(duì)照、15 μg/mL、35 μg/mL等3個(gè)茶多酚濃度的細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚提取物總多酚含量測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出，黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶茶多酚提取物中總多酚含量分別為434.11（±8.76）、401.94（±2.90）、282.19（±6.47 ）mg GAE/g。

2.2 不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

從表1可以看出，當(dāng)黃山毛峰茶多酚提取物濃度在5～25 μg/mL范圍時(shí)，HCT116細(xì)胞抑制率隨著其濃度的上升而上升，且與對(duì)照相比差異極顯著，說(shuō)明黃山毛峰茶多酚提取物對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且作用強(qiáng)度隨濃度的增大而增大；茶多酚提取物濃度為25 μg/mL時(shí)，HCT116細(xì)胞的抑制率最大（73.66%，P＜0.01），抑制效果顯著。當(dāng)大紅袍茶多酚提取物濃度在5～35 μg/mL范圍時(shí)，HCT116細(xì)胞抑制率隨著其濃度的上升而上升，且與對(duì)照相比差異極顯著，表明大紅袍茶多酚提取物對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且具有量效相關(guān)性；茶多酚提取物濃度為35 μg/mL時(shí)，HCT116細(xì)胞的抑制率最大（54.65%，P＜0.01），抑制效果明顯。祁門(mén)紅茶茶多酚提取物濃度在5～35 μg/mL范圍時(shí)，HCT116細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的抑制，與對(duì)照比較差異顯著，表明祁門(mén)紅茶茶多酚提取物處理HCT116細(xì)胞72 h后呈現(xiàn)一定量效相關(guān)性；茶多酚濃度為35 μg/mL時(shí)，HCT116細(xì)胞的抑制率最大（55.05%，P＜0.01），具有一定抑制效果。

表1 3種茶葉茶多酚提取物對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制率（%）

濃度在5～35 μg/mL范圍時(shí)，3種不同發(fā)酵程度茶葉中的茶多酚提取物均對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。從圖1可以看出，黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶茶多酚提取物作用HCT116細(xì)胞72 h的IC50分別是11.86、21.46、30.96 μg/mL，處理間差異顯著。3種茶多酚提取物對(duì)HCT116細(xì)胞作用的IC50值大小比較如下：未發(fā)酵茶黃山毛峰茶多酚提取物IC50＜半發(fā)酵茶大紅袍茶多酚提取物IC50＜全發(fā)酵茶祁門(mén)紅茶茶多酚提取物IC50。表明隨著茶葉發(fā)酵程度的增加，對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用減弱。

圖1 不同茶葉茶多酚提取物作用HCT116細(xì)胞72 h后的IC50值

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制作用

從圖2可以看出，黃山毛峰對(duì)照的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，透明度大，折光性強(qiáng)，且細(xì)胞數(shù)量較多；15 μg/mL黃山毛峰茶多酚提取物處理后的細(xì)胞，相較于對(duì)照來(lái)說(shuō)，有少數(shù)的細(xì)胞萎縮變圓，有凋亡小體出現(xiàn)；35 μg/mL黃山毛峰茶多酚提取物處理后的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀況差，折光性弱，絕大部分貼壁細(xì)胞皺縮成圓形，細(xì)胞間質(zhì)消失，凋亡小體增多，細(xì)胞數(shù)量大幅減少，與對(duì)照相比有顯著差異。大紅袍茶對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞較密集；15 μg/mL大紅袍茶多酚提取物處理后的細(xì)胞，相較對(duì)照有少數(shù)細(xì)胞皺縮成圓形，出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少；35 μg/mL大紅袍茶多酚提取物處理后的細(xì)胞大部分皺縮、變圓，體積縮小，細(xì)胞不連成片狀，細(xì)胞大量減少，與對(duì)照相比有明顯差異。祁門(mén)紅茶對(duì)照細(xì)胞處于貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，呈現(xiàn)無(wú)色透明，連成片狀且細(xì)胞較密集；15 μg/mL祁門(mén)茶多酚提取物處理后的細(xì)胞，出現(xiàn)少量細(xì)胞皺縮，變圓，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少；35 μg/mL祁門(mén)茶多酚提取物處理后的細(xì)胞皺縮，變圓，體積縮小，細(xì)胞數(shù)量減少。

圖2 不同茶葉茶多酚提取物作用72 h后的HCT116細(xì)胞（10×10）

可見(jiàn)，在35 μg/mL的相同濃度下，不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚提取物對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響程度不同。黃山毛峰和大紅袍茶多酚提取物處理后的細(xì)胞數(shù)量相較對(duì)照組明顯減少，貼壁細(xì)胞形態(tài)大多數(shù)皺縮、變圓，生長(zhǎng)狀況差，折光性差，產(chǎn)生大量凋亡小體。祁門(mén)紅茶茶多酚提取物處理后的細(xì)胞相較上述兩組，數(shù)量減少程度最小，形態(tài)改變程度最小。

3 結(jié)論與討論

茶多酚是茶葉中最主要的活性成分，包括兒茶素、黃酮類、酚酸類、花青素等。其中兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，約占茶多酚總量的70%～80%，主要含有兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表沒(méi)食子酸兒茶素（EGC）以及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）等多種活性物質(zhì)［12］。雖然在不同種類茶葉中，茶多酚類物質(zhì)均為主要化學(xué)成分［13］，但不同品種、不同產(chǎn)地、不同品質(zhì)茶葉中茶多酚提取物的含量、組成成分卻有較大區(qū)別［14-16］。茶葉加工方式，尤其是發(fā)酵過(guò)程會(huì)對(duì)茶葉茶多酚組成成分產(chǎn)生極大影響［17］。茶多酚提取物的活性作用主要是由不同構(gòu)成成分綜合作用的結(jié)果［18-19］。本研究對(duì)黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶茶多酚提取物中的總多酚含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，經(jīng)半發(fā)酵工藝處理后的大紅袍和全發(fā)酵工藝處理后的祁門(mén)紅茶，其茶多酚提取物中的總多酚含量相較未發(fā)酵的黃山毛峰茶多酚提取物中的總多酚有不同程度的下降，且發(fā)酵程度越高，總多酚含量下降越多。推測(cè)可能與茶葉在發(fā)酵過(guò)程中，多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合生成茶黃素、茶紅素等其他物質(zhì)［20］，導(dǎo)致多酚含量下降有關(guān)。

本研究MTS試驗(yàn)結(jié)果表明，黃山毛峰、大紅袍、祁門(mén)紅茶的茶多酚提取物對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖均有抑制效果。且在特定濃度范圍內(nèi)，3種茶葉茶多酚提取物對(duì)HCT116細(xì)胞作用的IC50值有顯著差異，且發(fā)酵程度越高的茶葉提取物對(duì)HCT116細(xì)胞作用的IC50值越高，抑制效果越小。3種茶葉茶多酚對(duì)HCT116的抑制作用與茶多酚提取物中總多酚含量具有一定的量效關(guān)系。已有研究表明，綠茶在貯藏過(guò)程中茶多酚和黃酮含量的減少與抗氧化活性的降低趨勢(shì)具有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系［21］，這也與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究進(jìn)一步證實(shí)了茶多酚是茶葉中主要抗癌活性成分［22］，且茶葉在不同發(fā)酵工藝過(guò)程中，引起了多酚氧化酶活性的改變，進(jìn)而影響到茶多酚氧化聚合反應(yīng)機(jī)制，促使茶葉內(nèi)多酚類物質(zhì)含量、組成成分、分子結(jié)構(gòu)等的改變，從而產(chǎn)生不同的生理活性［23］。本研究中3種不同發(fā)酵程度茶葉茶多酚表現(xiàn)出的不同抑癌效果可能也與此有關(guān)。

通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察，在特定濃度條件下，黃山毛峰茶多酚提取物和大紅袍茶多酚提取物作用HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況發(fā)生明顯改變，貼壁細(xì)胞皺縮、變圓，凋亡小體增多，折光性差。祁門(mén)紅茶茶多酚提取物作用后，細(xì)胞也出現(xiàn)一定程度凋亡特征，但相較前兩種茶多酚提取物形態(tài)改變程度小，這也進(jìn)一步證實(shí)了MTS試驗(yàn)結(jié)果。