膿毒血癥性急性腎損傷的發(fā)生機制

馬成龍，曾加禮

膿毒血癥是指致病菌感染導(dǎo)致的宿主反應(yīng)紊亂，引發(fā)的致命性器官功能障礙的病癥[1-2]。急性腎損傷（AKI）是膿毒血癥常見且最嚴重的并發(fā)癥[3]。膿毒血癥性AKI的主要臨床表現(xiàn)為腎小管上皮細胞出現(xiàn)急性損傷，提示患者病情加重，甚至可能引起多臟器衰竭。研究表明，膿毒血癥性AKI的發(fā)病機制與腎臟血流動力學(xué)變化、炎癥介質(zhì)浸潤、腎臟細胞凋亡等相關(guān)[4]，其中腎小管上皮細胞凋亡可能起重要作用[5]。有研究報道，Tec非受體型激酶與膿毒血癥的發(fā)病機制相關(guān)，成為治療膿毒血癥的新靶點[6]，但是Tec非受體激酶在膿毒血癥AKI發(fā)病中扮演什么角色，是否與膿毒血癥AKI的發(fā)病過程相關(guān)，尚未得知。因此，本研究分析討論了Tec非受體激酶在膿毒血癥性AKI發(fā)病過程中的變化，探討其在膿毒血癥性AKI發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 Immun-blot PVDF膜（Bio-Rad公司，美國）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce公司，美國）；LC3-Ⅱ及 Beclin-1的蛋白單克隆抗體（Pierce公司，美國）；Experion全自動電泳系統(tǒng)（Bio-rad公司，美國）。

1.2 動物分組及樣本采集 選取健康雄性清潔級雄性SD大鼠（中科院上海實驗動物中心，合格證書2015-025）32只，隨機分為2組，每組16只，常規(guī)飼養(yǎng)7 d。模型組給予腹腔注射脂多糖（LPS）20 mg/kg建立膿毒血癥模型，建模成功后進行充分的液體復(fù)蘇。正常組給予腹腔注射等量生理鹽水。分別在建模后1、24和48 h，麻醉動物，心臟穿刺取血，置于EP管中靜置，待凝固后于37℃水浴30 min，離心分離血清備用（當天檢測）。此外，在建模后1、24和48 h，每組各隨機選擇4只大鼠，取右腎上極組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，蘇木素伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察腎小管細胞形態(tài)。

1.3 檢測指標

1.3.1 血生化指標 使用A720全自動生化分析儀(北京松上技術(shù)有限公司)，采用紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測血清尿素氮（BUN）水平，采用改良苦味酸速率法檢測血清肌酐（Cr）水平，采取免疫比濁法檢測血清胱抑素C水平（CysC），采用ELISA法檢測血清白介素 -1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)水平。

1.3.2 腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)評分 采用Paller法，對大鼠腎小管間質(zhì)損傷程度進行評估。在光鏡下，每個大鼠腎組織隨機選取10個無重疊視野（放大倍數(shù)×200），觀察腎小球以及腎小管間質(zhì)細胞形態(tài)，通過病理?？漆t(yī)生采取盲法的原則，對病理觀察結(jié)果進行評分，評分標準：腎小管明顯擴張、細胞扁平，計1分；刷狀緣損傷，計1分；脫落，計2分；管型，計2分；腎小管管腔內(nèi)有脫落、壞死的細胞（未成管型或細胞碎片），計2分。得分越高，表示腎小管間質(zhì)損傷越嚴重。

1.3.3 腎小管自噬體膜標志蛋白微管相關(guān)蛋白水平檢測 采用 Western blot法檢測 Tec、LC3-Ⅱ及Beclin-1的表達水平，將Western blot膠片掃描，通過凝膠成像處理系統(tǒng)，測定目的條帶的光密度，以對應(yīng)的β-actin蛋白條帶為對照，計算Tec、LC3-Ⅱ及Beclin-1與β-actin蛋白積分光密度比值（ODI）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，行t檢驗；計數(shù)資料以例和百分率表示，行χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腎功能變化 與正常組相比，建模后1 h，模型組血Cr和BUN無明顯變化，而血CysC已升高（P＜ 0.05）；建模后 24 h，血 Cr、BUN 及 CysC 水平均升高；建模后48 h，血Cr及BUN水平下降到接近正常范圍，而血CysC水平仍明顯高于正常組（P＜0.05）。 見表 1。

2.2 兩組炎癥因子水平及腎小管間質(zhì)損傷程度變化 在建模后各時間點，模型組TNF-α、IL-1β水平均升高，其中TNF-α在建模后1 h即升高，之后顯著降低，但48 h時仍明顯高于正常對照組（P＜0.05)；IL-1β在建模后1 h即開始升高，24 h時達峰值，其后開始下降，但均明顯高于對照組（P＜0.05)。模型組在建模后各個時間點腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)均明顯升高（P＜0.05)，尤其在建模24 h時最為明顯。見表2。

2.3 兩組腎小管Tec激酶蛋白水平及自噬體膜標志蛋白比較 與正常組比較，模型組各個時間點Tec、LC3-Ⅱ及 Beclin-1水平均呈現(xiàn)先升高，后降低變化趨勢，但均顯著高于正常組（P＜0.05)。見表3。

表1 兩組不同時間腎功能變化(n=16）

表2 兩組炎癥因子水平及腎小管間質(zhì)損傷程度變化（n=16)

表4 兩組腎小管Tec激酶蛋白水平及自噬體膜標志蛋白比較（n=16)

3 討論

膿毒血癥是一種臨床上十分常見的能夠?qū)е禄颊呷矶鄠€臟器發(fā)生損傷的病理過程[7]，是由于感染而導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，嚴重者可導(dǎo)致患者死亡[8]。AKI是膿毒血癥的常見并發(fā)癥之一。TNF-α及IL-1β均是炎癥因子，能夠引發(fā)細胞因子風暴的發(fā)生，并放大機體的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組在建模后 1、24、48 h 各時間點，TNF-α、IL-1β水平均明顯升高，說明膿毒血癥早期就可引起大量釋放炎性因子，TNF-α及IL-1β參與了膿毒血癥性AKI的發(fā)生、發(fā)展過程。

CysC是一類非糖基化的堿性小分子蛋白[9-10]，是反映腎臟功能的重要指標，CysC在腎功能正常時，由腎小球濾過，在近曲小管重吸收而被清除。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，建模后1 h，模型組血BUN及Cr水平無明顯變化，而血CysC已明顯升高；建模后24 h，模型組血Cr、BUN及CysC水平均明顯升高；建模后48 h，血Cr及BUN水平下降到接近正常范圍，而血CysC水平仍明顯高于正常組，表明建模后大鼠腎小球過濾功能及腎小管重吸收及分泌功能均損傷，且在膿毒血癥的早期就存在腎臟損傷。

Tec激酶家族屬于目前研究較多的熱點蛋白。Tec非受體激酶與受體型蛋白酪氨酸不一樣，其參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠?qū)Χ喾N關(guān)鍵信號傳導(dǎo)路徑進行調(diào)節(jié)[11]。國外研究發(fā)現(xiàn)，Tec家族在單核巨噬細胞的功能中具有十分關(guān)鍵的作用[12]，并可能與Toll樣受體蛋白相互作用，通過免疫途徑調(diào)節(jié)細胞的自噬和凋亡。膿毒血癥性AKI的發(fā)病機制與腎小管上皮細胞的凋亡密切相關(guān)，而Tec非受體激酶是否通過免疫途徑調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞的自噬和凋亡，目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，建模后各個時間點模型組腎小管細胞Tec非受體激酶蛋白水平明顯升高，尤其24 h更為明顯，48 h較前有所降低，但較正常組升高明顯。這些結(jié)果與大鼠建模后腎功能相關(guān)指標的變化趨勢大體一致，由此推測，Tec非受體激酶可能參與了膿毒血癥性AKI的發(fā)生、發(fā)展，但具體的作用機制還需要更進一步研究分析。

LC3-Ⅱ及 Beclin-1均為自噬體膜標志蛋白，與細胞間自噬或凋亡相關(guān)。自噬與凋亡之間是一種十分復(fù)雜的交互調(diào)控，二者可以被很多應(yīng)激刺激共同激活，甚至能夠相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化等。在本研究中，建模后各個時間點模型組自噬體膜標志蛋白表達LC3-Ⅱ及Beclin-1的蛋白表達均明顯升高，尤其24 h時最為明顯，48 h時雖有所降低，但較正常組仍升高明顯，表明膿毒血癥大鼠的自噬體膜標記蛋白水平上升，機體內(nèi)自噬體數(shù)量上升，并有可能誘發(fā)細胞凋亡，這一現(xiàn)象與膿毒血癥AKI的發(fā)病具有密不可分的關(guān)系[13]。

綜上所述，Tec非受體激酶可能參與膿毒血癥AKI的早期發(fā)病，并可能通過參與免疫途徑調(diào)節(jié)細胞自噬和凋亡的機制而發(fā)揮作用。