幽門螺桿菌對抗生素的耐藥機(jī)制進(jìn)展研究

丁曉蕊 賈興芳 劉成霞

[摘要] 伴隨幽門螺旋桿菌（Hp）根除治療法的逐步推廣與使用，醫(yī)學(xué)界開始關(guān)注抗生素耐藥性越發(fā)嚴(yán)重的情況，該耐藥性已被發(fā)現(xiàn)對一些Hp治療方法的根治率有不利影響。因此，對幽門螺旋菌耐藥分子機(jī)制的鉆研正成為國內(nèi)外研究的熱點話題。例如，硝基咪唑類（甲硝唑）的耐藥機(jī)制和rdxA、FrxA基因突變有重要關(guān)系。大環(huán)內(nèi)酯類（克拉霉素）的耐藥機(jī)制和Hp中23SrRNA里V區(qū)域的點突變存在密切關(guān)系。阿莫西林一類藥物的耐藥機(jī)制和青霉素結(jié)合蛋白存在關(guān)聯(lián)。作為快速抑菌劑的四環(huán)素類的耐藥機(jī)制和Hp16SrRNA序列的突變有關(guān)聯(lián)。對耐藥機(jī)制的分類研究為Hp的進(jìn)一步診斷及醫(yī)治奠定了重要基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 幽門螺旋菌；抗生素；耐藥機(jī)制；硝基咪唑類；大環(huán)內(nèi)酯類

[中圖分類號] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）07（b）-0193-04

Research Progress of Antibiotic Resistance Mechanism of Helicobacter Pylori

DING Xiao-rui， JIA Xing-fang， LIU Cheng-xia

Gastroenterology Department， Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256600 China

[Abstract] With the gradual promotion and use of Helicobacter pylori （Hp） eradication therapy， the medical community has begun to pay attention to the increasingly serious situation of antibiotic resistance， which has been found to have an adverse effect on the cure rate of some Hp treatment methods. Therefore， the study of the molecular mechanism of Helicobacter pylori resistance has become a hot topic at home and abroad. For example， the resistance mechanism of nitroimidazoles （metronidazole） has an important relationship with mutations in rdxA and FrxA genes. The resistance mechanism of macrolides （clarithromycin） is closely related to point mutations in the V region of 23S rRNA in Hp. The drug resistance mechanism of amoxicillin and penicillin-binding proteins is related. The resistance mechanism of tetracyclines as a rapid bacteriostatic agent is related to the mutation of the Hp16SrRNA sequence. The classification of drug resistance mechanisms has laid an important foundation for the further diagnosis and treatment of Hp.

[Key words] Helicobacter pylori； Antibiotics； Drug resistance mechanism； Nitroimidazole； Macrolides

作為一種微需氧菌，幽門螺旋菌在顯微鏡下呈現(xiàn)為一端有鞭毛的螺旋形結(jié)構(gòu)，它是格蘭陰性菌的一種。檢驗醫(yī)學(xué)已明確該種菌和胃腸消化道的常見4種疾病有密切的聯(lián)系，即消化性潰瘍、慢性胃炎、胃粘膜淋巴瘤和胃癌。上世紀(jì)90年代中期，世界衛(wèi)生組織已將Hp定為首類致癌因子。因此，對Hp的根治療法是臨床上醫(yī)治慢性胃病的關(guān)鍵手段，從根本上上去除Hp不但可提升消化性潰瘍恢復(fù)的速度，還能有效抑制胃腸道潰瘍，并且能降低初期胃癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率?，F(xiàn)階段，根除Hp的常用抗生素較多，主要為大環(huán)內(nèi)酯類（如克拉霉素）、硝基咪唑類（如甲硝唑）、β—內(nèi)酰胺類（如阿莫西林）、喹諾酮類（左氧氟沙星）、四環(huán)素類等[1]。不過由于抗生素的普遍使用，Hp的耐藥性逐漸提升。因而對Hp耐藥機(jī)制方向的探究對臨床后續(xù)的診斷及醫(yī)治有突出的作用，該文對國內(nèi)外有關(guān)治療藥物和相應(yīng)的耐藥機(jī)制展開綜述。

細(xì)菌的耐藥性大致可分為以下幾點：①天然耐藥性。推測其主要原因為細(xì)菌缺乏對該藥物靈敏的靶位，或是細(xì)菌存在天然的防御導(dǎo)致藥物難以順利進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)。②耐藥性獲得。由于細(xì)菌獲得了耐藥基因，致使先前敏感的細(xì)菌成為了耐藥菌。檢驗發(fā)現(xiàn)，Hp的耐藥主要是獲得性耐藥，因為根除Hp的指征掌握不完備，Hp根除在諸多消化道不良反應(yīng)的治療中存在不恰當(dāng)?shù)氖褂茫鹂股氐臑E用，使細(xì)菌得到耐藥基因。統(tǒng)計結(jié)果表明，發(fā)達(dá)地區(qū)使用克拉霉素多于發(fā)展中地區(qū)，因而其耐藥率也相應(yīng)較高，甲硝唑應(yīng)用較少，耐藥水平略低，說明耐藥率和藥物的使用量成正比。不過，女性患者服用甲硝唑后其耐藥率偏高，這與這類人群長期使用甲硝唑用以醫(yī)治泌尿感染，甲硝唑使用量較高有直接關(guān)系。因此，抗生素的頻繁使用是引起耐藥性提升的關(guān)鍵因素。

1 Hp對硝基咪唑類藥物（甲硝唑）耐藥機(jī)制

甲硝唑的抗菌功效一般是通過以下方式實現(xiàn)的：它的一氧化氮基團(tuán)于細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過硝基還原酶還原成為羥胺衍生物，該種還原物能引起DNA的損害、斷裂等，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。甲硝唑的還原活性表達(dá)一般是從目標(biāo)細(xì)胞的氧化還原系統(tǒng)中產(chǎn)生的。一旦系統(tǒng)中的還原電位不及甲硝唑時，此系統(tǒng)具有將電子轉(zhuǎn)移給甲硝唑的能力，這時甲硝唑就成為了對細(xì)胞存在毒性的物質(zhì)。甲硝唑還原電位為415 mV，若在厭氧菌里，它的負(fù)電位能達(dá)到-460 mV，因而該類細(xì)菌對甲硝唑比較敏感[2]。盡管Hp的培養(yǎng)性質(zhì)為微需氧，不過甲硝唑?qū)p的功用類似于對厭氧菌的作用。臨床醫(yī)學(xué)證實，Hp對甲硝唑有極高的耐藥率，但它的作用機(jī)制目前尚不清楚，現(xiàn)階段有關(guān)Hp對甲硝唑耐藥機(jī)制有下列幾種論點：

1.1 rdxA的基因突變

不少學(xué)者均認(rèn)為Hp的耐藥和rdxA的基因突變有關(guān)系。rdxA的基因長度為630 bp，若發(fā)生突變會促使蛋白的正常翻譯提前結(jié)束，進(jìn)而導(dǎo)致硝基還原酶失去活性。該過程也在DNA轉(zhuǎn)化、聚合酶鏈反應(yīng)中被發(fā)現(xiàn)。實驗還表明，存在于甲硝唑耐藥菌株的基因，rdxA擁有更明顯的突變率。不過，有研究也認(rèn)為Hp對甲硝唑的耐藥性并不是完全因為rdxA基因的突變[3]。在檢驗時也發(fā)現(xiàn)甲硝唑耐藥的Hp菌株中有尚未發(fā)生突變的rdxA基因。使用rdxA基因突變引起的甲硝唑耐藥菌株只呈現(xiàn)出中等層級的耐藥，僅用rdxA基因的突變難以說明分離的耐藥菌株里有不同的耐藥層級。以往的實驗一直未能發(fā)現(xiàn)存在特別的核苷酸序列和Hp的耐藥表型存在關(guān)聯(lián)，在甲硝唑的菌株中同樣有rdxA的基因突變[4]。

1.2 frxA、frxB中的基因突變

甲硝唑產(chǎn)生藥理功效是需要經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)部氧化還原體系實現(xiàn)甲硝唑還原。無論在厭氧菌還是微需氧菌中，硝基還原酶不僅有rdxA蛋白，還涵蓋了frxA、frxB。不僅如此，在上述兩種菌種中，其直接的電子供體均源自frxA、frxB，由于其作用使細(xì)胞內(nèi)的電位>-415 mV。在各種硝基還原酶基因中，rdxA、fdxB、frxA基因突變除外，另外的硝基還原酶突變均對細(xì)胞有致死作用。研究表明，frxA、fdxB發(fā)生突變時，會引起甲硝唑敏感菌和耐藥菌的MIC上升。若已失去活性的基因已進(jìn)frxA入甲硝唑敏感菌中，此種菌會立即轉(zhuǎn)化為耐藥菌，相反情況也是如此[5]。對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化也能夠得出相同的結(jié)論，因此有理由認(rèn)為frxA、fdxB基因突變對甲硝唑的耐藥性有一定作用。不過，在不包含rdxA基因突變的frxA對Hp甲硝唑耐藥作用方面尚存較大爭議[6]。

1.3 甲硝唑攝入量降低或主動排出量上升

由于Hp為革蘭陰性桿菌，它的外膜在一定程度上可阻礙疏水性藥物的通透性。甲硝唑則為硝基類藥物，是一種疏水性藥，沒有辦法穿透膜的阻礙而順利擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)部。相關(guān)咪唑類化合物可對甲硝唑形成抑制作用，提示甲硝唑可能采取了易化擴(kuò)散的形式最終到達(dá)Hp體內(nèi)。膜耐藥是否也參與了甲硝唑的耐藥機(jī)制呢？有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)維拉帕米對外排有抑制性，因而可調(diào)整耐甲硝唑Hp的MIC，這是其他該拮抗劑無法完成的，因此推測可能是由于限制了Hp膜上的藥物泵引起。依據(jù)能量聯(lián)系的形式可將藥物外排分為兩種形式：其一為次級轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，可能受CCCP抑制；另一種為膜轉(zhuǎn)運和ATP的結(jié)合，由ATP水解排出細(xì)胞內(nèi)的毒物質(zhì)。此種轉(zhuǎn)運方式難以被CCCP抑制[8]。有分析指出，使用CCCP等能量抑制劑后，耐甲硝唑Hp細(xì)胞內(nèi)濃度反倒降低，若無第一種轉(zhuǎn)運形式，耐藥Hp是否包含P-糖蛋白？維拉帕米可以提升藥物外排為條件降低MIC，這和該藥物在腫瘤細(xì)胞上的功效有相同之處。

2 克拉霉素的耐藥機(jī)制及檢測方案

研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥存在多因素作用，該菌的23SrRNA某些基因腺嘌呤發(fā)生突變，轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤，另一些則突變?yōu)榘奏?。前一種突變被認(rèn)為是幽門螺旋桿菌耐克拉霉素的主要原因。對T2182C突變的發(fā)現(xiàn)過程指示基因突變能同時發(fā)生2～3個。不過也有學(xué)者指出，該突變和克拉霉素的耐藥并無直接關(guān)聯(lián)。有分析認(rèn)為，幽門螺旋桿菌對克拉霉素的耐藥還可能受區(qū)域、人種、年齡等因素的影響[9]。該菌種對克拉霉素的耐藥作用有顯著的地域區(qū)別，如在伊朗耐藥率可達(dá)45%以上，而意大利則不足10%。另外，非消化性潰瘍患者對克拉霉素的耐藥率明顯比消化性潰瘍患者高。對非甾體類抗炎藥物的服用也會增加對克拉霉素的耐藥性。此外，飲食結(jié)構(gòu)、是否存在吸煙習(xí)慣均會對其耐藥率產(chǎn)生影響。對幽門螺旋桿菌耐克拉霉素的檢測方案多建立在PCR分子診斷技術(shù)上，該技術(shù)以耐藥基因突變?yōu)榛A(chǔ)。使用熒光定量PCR能在1 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)23SrRNA的突變。聯(lián)合應(yīng)用Biprones技術(shù)與Realtime PCR能實現(xiàn)非創(chuàng)傷的幽門螺旋桿菌感染檢測，提升23SrRNA的點突變，加之FRET技術(shù)的引入，可使用溶解曲線對擴(kuò)增的產(chǎn)物開展分析，在短時間內(nèi)同時對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性與幽門螺旋桿菌感染進(jìn)行檢測。焦磷酸測序法也被證實為一種高效檢測幽門螺旋桿菌對克拉霉素耐藥的辦法[10]。在眾多檢測方案中，比色法DNA芯片以其成本低、操作便捷、高特異性得到了臨床認(rèn)同，特別在發(fā)展中國家的中小醫(yī)院中。其芯片對野生株及其他位置存在的單點突變均能給予檢測。

3 左氧氟沙星的耐藥機(jī)制及檢測方案

幽門螺旋桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥基本是由該類藥物耐藥決定區(qū)突變引起的。目前已檢測出13種突變，位于基因gyrA的不同位點上。左氧氟沙星的耐藥也是該基因位點突變形成的。gyrB基因于463位點上發(fā)生的點突變是耐藥的新機(jī)制。由于不同環(huán)境對抗生素的使用情況和適應(yīng)證標(biāo)準(zhǔn)的制訂方面存在差異，幽門螺旋桿菌對左氧氟沙星也存在地區(qū)、年齡等差別[11]。例如其在兒童與成人中有明顯差異：兒童耐藥率約為8%，成人超過14%。不同地域?qū)υ撍幬锏哪退幝室膊幌嗤?，以南、中歐地區(qū)最高（18.6%），馬來西亞等地區(qū)最低（約0%）。對該類藥物耐藥機(jī)制的檢測主要集中于突變的基因。常規(guī)采用PCR特異性擴(kuò)增技術(shù)，其后進(jìn)行核苷酸序列測定。有學(xué)者利用突變時菌株的溶解溫度進(jìn)行鑒別，能在3～5 h內(nèi)識別突變。此外，反向雜交PCR線性探針、DNA條帶方法學(xué)操作方便，能在臨床上推廣。

4 Hp對β—內(nèi)酰胺類耐藥機(jī)制研究

作為一種氨基青霉素，阿莫西林的作用機(jī)制為與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）進(jìn)行結(jié)合，對細(xì)胞壁粘肽合酶進(jìn)行抑制，進(jìn)而阻斷其合成過程，造成細(xì)菌的胞壁形成缺損，使菌體由于膨脹而分裂。它對細(xì)菌的致死作用還有引起細(xì)菌自溶酶活性水平，若喪失自溶酶的突變株就會呈現(xiàn)出耐藥[12]。對β—內(nèi)酰胺類的耐藥，一般是因為水解該類酶或涉及修正青霉素結(jié)合蛋白的突變。但對其耐藥Hp菌株進(jìn)行檢驗并未發(fā)現(xiàn)它具備β—內(nèi)酰胺酶活性，提示Hp并非經(jīng)合成形成耐藥性。PBPs發(fā)生突變是引起阿莫西林耐藥的基本原因。近年來全世界關(guān)于阿莫西林出現(xiàn)耐藥性的報道與日俱增，某些地區(qū)該藥物的耐藥率已達(dá)到18%。本世紀(jì)我國的浙江地區(qū)已發(fā)現(xiàn)耐阿莫西林的菌株，耐藥率約9%。因此，阿莫西林一類藥物耐藥率的上升會影響Hp根治的進(jìn)程。

5 Hp對四環(huán)素的耐藥機(jī)制

該藥是一種快速抑菌劑。其藥理作用為：藥物通過細(xì)胞外膜蛋白的彌散作用以及利用細(xì)胞內(nèi)膜能量依賴性轉(zhuǎn)移方式滲入細(xì)胞內(nèi)，阻礙氨基酰-tRNA和核糖體的聯(lián)系，達(dá)到控制肽鏈延伸及蛋白合成的作用?，F(xiàn)階段認(rèn)為其耐藥機(jī)制和Hp16SrRNA序列突變存在關(guān)聯(lián)。有研究在一位70歲結(jié)腸癌手術(shù)患者身上提取到Hp四環(huán)素耐藥菌株。該患者使用過三種不同Hp治療方案，前兩種分別以阿莫西林、甲硝唑為主，后一種加入了四環(huán)素。療程>1年?；顧z胃體和胃竇部，均能正常分離同種形態(tài)、氧化酶、過氧化酶測試為陽性的菌株[13]。應(yīng)用E試驗對上述藥物開展藥敏試驗，最終顯示2個不同部位均存在甲硝唑及四環(huán)素的耐藥菌株。不過，四環(huán)素的耐藥機(jī)制尚不十分明確。

6 小結(jié)

伴隨近年來抗生素在去除Hp感染過程中的普遍使用，耐藥菌株也在逐年增加，因而Hp的根除受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。特別是甲硝唑等硝基咪唑類藥物的耐藥性使其已不適合成為常規(guī)治療方案。醫(yī)學(xué)界正探索設(shè)計一種能迅速、準(zhǔn)確、操作便捷的檢測方法應(yīng)對，它對今后臨床用藥的引導(dǎo)有突出的作用。隨著基因芯片技術(shù)的不斷完善，HRM憑借它迅速、成本低、敏感度好、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性等優(yōu)勢，已在國外形成一種應(yīng)用于突變掃描及基因分型的遺傳學(xué)分析法，目前已在一定范圍內(nèi)逐步推廣。此二者的臨床應(yīng)用價值較高，是當(dāng)下研究的熱點問題。此外，掌控Hp根治的適應(yīng)證、提升治療依從性、聯(lián)合用藥及中西醫(yī)結(jié)合均為當(dāng)前研究的重點。

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（收稿日期：2018-04-13）