不同仔豬血清濃度對金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

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(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321000；2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000)

0 引言

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，成纖維細(xì)胞具有易于培養(yǎng)，增殖快，形態(tài)和遺傳性能穩(wěn)定，可長期、完整、大量地保存生物體遺傳信息的特點[1]。目前，成纖維細(xì)胞被廣泛用于生產(chǎn)體細(xì)胞克隆豬、轉(zhuǎn)基因豬以及制作豬誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)多應(yīng)用異體血清，除了非同源外，在異體血清應(yīng)用的同時,也造成了自體血清的浪費。試驗以金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞為研究對象，探討用不同濃度仔豬血清培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞在3種不同仔豬血清濃度培養(yǎng)基中的生長情況，為仔豬血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1～3月齡金華豬仔豬耳緣組織

1.2 主要試劑和儀器

DMEM(Hyclone)，25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Fisher)，血球細(xì)胞計數(shù)器(上海申工)，仔豬血清(自備)，青霉素、鏈霉素混合液(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone)， PBS液(Hyclone),CKX41倒置顯微鏡(OLYMPAS)，311型二氧化碳培箱(Thermo)，酶標(biāo)儀(伯樂)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料

選1～3月齡的金華豬仔豬，在豬耳緣處選擇血管較少部位刮毛，無菌剪取一小部分組織，將組織塊放入含250IU/mL雙抗的PBS中，帶回實驗室。

1.3.2 處理

在超凈臺中將豬耳組織塊用75%酒精浸泡30～60 s，切取耳緣組織塊約0.5 cm×0.5 cm大小，把皮膚上的毛再次刮干凈放入無菌培養(yǎng)皿，再用雙抗PBS溶液洗滌3～5次。用眼科剪刀反復(fù)剪切，剪成1 mm3大小的小塊，用雙抗PBS洗滌3次，最后1次棄去上清液，沉淀的組織備用。

1.3.3 原代培養(yǎng)

采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，將組織塊貼于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每小塊間距約 0.3 cm，每瓶接種25～30塊。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使有組織塊的一面向上,然后在細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)分別加含5%、10%、15%仔豬血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。將有組織塊的一面向上放入培養(yǎng)箱，靜置4 h后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，然后放入CO2培養(yǎng)箱，5% CO2、37℃、飽和濕度下靜置培養(yǎng)2 d后置于倒置顯微鏡下觀察組織塊遷移率同時更換培養(yǎng)液[2]。

1.3.4 傳代培養(yǎng)

當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗2次后，再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液，37℃溫度下消化培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，在顯微鏡下看到大部分成纖維細(xì)胞脫壁，立即加入完全培養(yǎng)液終止消化，吹打細(xì)胞，使之分散。以1 000 r/min，離心5 min，棄上清， 再加入5 mL培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，再次以1 000 r/min ，離心5 min，棄上清液，以 2 mL培養(yǎng)液吹打重懸浮細(xì)胞，使用血球計數(shù)板用0.4%臺盼藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，使細(xì)胞密度為 2×105個/mL，隨后，接入新的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測

用含不同濃度仔豬血清培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，在96孔板上每孔加入100 μL，細(xì)胞濃度為1×104/mL，每組7孔，培養(yǎng)2 d后，每孔加入MTT溶液(5g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸棄上清液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇波長490nm，用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值(A值)[3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Graphpad prism5 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同組別數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同仔豬血清濃度培養(yǎng)情況觀察

金華豬耳緣組織塊培養(yǎng)用仔豬血清濃度為10%與15%時，培養(yǎng)3～4 d倒置顯微鏡下可見單個細(xì)胞沿組織塊周圍游離出來(圖1)，生長狀態(tài)好，培養(yǎng)8 d大量細(xì)胞從組織塊遷移出來(圖2)，培養(yǎng)12 d可以長滿培養(yǎng)瓶底(圖3)。仔豬血清濃度為5%時，培養(yǎng)到10 d后才見少量細(xì)胞沿組織塊周圍爬出，細(xì)胞生長緩慢，21 d左右才鋪滿培養(yǎng)瓶底。細(xì)胞傳代2～3次后，即可得到純化的成纖維細(xì)胞(圖4)，細(xì)胞呈梭形、三角形等，為典型的成纖維形態(tài)，胞質(zhì)近中央處有橢圓形胞核，成群細(xì)胞呈現(xiàn)束狀、漩渦狀等走勢。

圖1 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)3 d組織塊有少量細(xì)胞游離出來(100×)

圖2 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)8 d組織塊有大量細(xì)胞遷移出來(100×)

圖3 仔豬血清濃度為10%培養(yǎng)12 d組織塊細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底(200×)

圖4 仔豬血清濃度為10%傳代培養(yǎng)的第3代成纖維細(xì)胞(200×)

2.2 MTT檢測結(jié)果

金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞在含10%、15%仔豬血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長均旺盛，活力較強，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在含5%仔豬血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞活力明顯低于10%與15%仔豬血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(如圖5所示)

圖5 不同仔豬血清濃度對成纖維細(xì)胞活性增殖影響

3 討論

動物原代細(xì)胞培養(yǎng)主要分為2種方法，組織塊塊貼壁培養(yǎng)法和酶消化法[4]。本試驗采用組織塊貼壁方法培養(yǎng)豬耳緣組織成纖維細(xì)胞。該方法簡單，容易獲得成纖維細(xì)胞，但是純度不高，有上皮細(xì)胞的存在，根據(jù)不同類型細(xì)胞對胰酶的敏感度不同進(jìn)行純化，培養(yǎng)2～3代后方可獲得較純的成纖維細(xì)胞。

培養(yǎng)基是體外細(xì)胞培養(yǎng)賴以生存和增殖的基礎(chǔ),由于血清中含有多種人工合成營養(yǎng)液中所缺少的物質(zhì)，如生長激素和生長調(diào)節(jié)因子等，生長激素能調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命活動，生長因子能刺激細(xì)胞生長、增殖分化[5]。細(xì)胞培養(yǎng)常用的是胎牛血清，為避免異源血清帶來的危險損害和血源性傳播性疾病，故將仔豬血清應(yīng)用于豬耳緣組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。本試驗采用Hyclone公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)液，分別加入含仔豬血清量為5%、10%、15%的培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，探討不同濃度的仔豬血清對金華豬耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，仔豬血清濃度在10%、15%時即可滿足成纖維細(xì)胞生長的營養(yǎng)需要，10%、15% 的仔豬血清濃度對細(xì)胞影響的差異并不顯著，所以采用含10%的仔豬血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞，即可滿足細(xì)胞生長的需要，又可節(jié)省血清用量。仔豬血清濃度為5%時，血清不能滿足細(xì)胞生長需要，細(xì)胞生長速度較慢，細(xì)胞活力明顯低于10%與15%仔豬血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞。綜上所述，仔豬血清濃度對金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)影響比較明顯，仔豬血清濃度為10%、15%時，二者對細(xì)胞培養(yǎng)狀況的影響差異不顯著(P>0.05)，二者與仔豬血清濃度為5%比較時差異顯著(P<0.05)，提示不同仔豬血清濃度的培養(yǎng)體系在對體外培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞有著特殊的影響。這與課題組早期實驗采用不同胎牛血清濃度對金華豬耳組織成纖維細(xì)胞體外生長的影響，屠平光等[6]結(jié)論一致，說明金華豬耳組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)不管用異體血清還是自體血清，最適培養(yǎng)血清濃度均為10%。

本試驗研究表明，用含10%濃度仔豬血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)金華豬耳組織成纖維細(xì)胞，可以滿足細(xì)胞生長活性和增殖能力的要求，為仔豬血清在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。