離體黑果枸杞再生途徑的研究

曹君邁,馬海軍,譚亞萍

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)是我國荒漠地區(qū)特有的一種野生植物[1]，是西北地區(qū)一種重要的中藥材，在藏藥中廣泛應(yīng)用[2]。我國對(duì)紅果枸杞的研究始于19世紀(jì)初期，而對(duì)野生黑果枸杞的研究卻晚了一個(gè)世紀(jì)。有關(guān)黑果枸杞的生理生態(tài)[3-4]、各種抗性[5-6]、營養(yǎng)成分分析和提取[7]、藥性及藥理學(xué)作用[8]、抗旱價(jià)值[9]以及開發(fā)利用前景[10]等方面已有大量文獻(xiàn)報(bào)道。正是基于學(xué)者的研究結(jié)果認(rèn)為黑果枸杞的保健及藥用價(jià)值遠(yuǎn)高于普通紅枸杞[11]，這樣導(dǎo)致市場對(duì)黑果枸杞的需求量劇增，同時(shí)以黑果枸杞為主要原料的藥品、茶品、保健品等系列產(chǎn)品的開發(fā)，從而推動(dòng)了黑果枸杞產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。面對(duì)多元化市場的需求，以及野生資源有限的局面，利用常規(guī)栽培方法已不能滿足枸杞產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，且常規(guī)栽培方法植株繁殖速度慢[12]，采用組織培養(yǎng)技術(shù)手段可有效提高種苗繁殖速度、緩解對(duì)野生資源破壞性的采挖。然而，關(guān)于黑果枸杞組織培養(yǎng)研究報(bào)道的文獻(xiàn)較少[13-15]，缺乏系統(tǒng)的、深入的研究，同時(shí)還存在生產(chǎn)成本高，繁殖系數(shù)低[14]，不同品種之間配方差異很大等問題，給標(biāo)準(zhǔn)化的工廠化生產(chǎn)帶來了一定難度。本研究試圖以愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)及葉片直接誘導(dǎo)小植株的再生途徑為研究目的，以期探討出黑果枸杞最佳的離體繁殖途徑，建立高效的無性繁殖技術(shù)體系，為野生黑果枸杞資源的充分保護(hù)和利用以及規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑果枸杞金塔種子來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)。以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)于2015年3月-2016年4月，在北方民族大學(xué)生科院組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以激素為處理因素，將各種外植體接種于不同處理的培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種15瓶，剔除污染瓶后，每種處理統(tǒng)計(jì)10瓶，以葉、莖段、愈傷組織做外植體時(shí)，每瓶接種5個(gè)，其余材料做外植體時(shí)，每瓶接種3個(gè)。

1.2.2 無菌苗的獲得

(1)種子的消毒。挑選150粒形狀大小、飽滿度一致的黑果枸杞種子，用蒸餾水泡后放入4℃冰箱備用。第二天取出放入已開啟滅菌的超凈工作臺(tái)上，將種子放入裝有70%乙醇的無菌培養(yǎng)皿中消毒5s左右，用無菌蒸餾水反復(fù)洗滌3次，再用2%的次氯酸鈉溶液將種子浸泡消毒25 min，繼續(xù)用無菌蒸餾水洗滌3次，洗去殘余溶液，洗滌后放在滅菌濾紙上，吸干種子表面的水分。

(2)接種。將消毒后晾干的種子接入MS培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接15粒黑果枸杞種子，一共10瓶，編號(hào)后送入培養(yǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)。

(3)培養(yǎng)條件。固體培養(yǎng)基：白砂糖20 g·L-1，瓊脂5 g·L-1，MS營養(yǎng)成分，pH值調(diào)至5.8～6.0；培養(yǎng)室溫度25 ℃左右；光/暗周期15 h/9 h，光強(qiáng)2 000 Lx左右。

1.2.3 愈傷組織的獲得 待黑果枸杞的無菌苗長到6 cm左右時(shí)，以葉片和莖段為外植體，要求規(guī)格如下：葉片為0.5～1 cm2，莖段要截取成帶3片葉且高度為2 cm大小，接種到激素配比不同的7種培養(yǎng)基上，即：1. 2,4-D 0.1 mg·L-1、2. 2,4-D 0.2 mg·L-1、3. 2,4-D 0.3 mg·L-1、4. 2,4-D 0.4 mg·L-1、5.0 mg·L-1(無激素)、6. IBA 0.2 mg·L-1、7. NAA 0.2 mg·L-1。

1.2.4 叢生芽的獲得 取長勢一致且旺盛的愈傷組織，將其分割成大小約1 cm3的團(tuán)塊，分別接種到激素配比不同的4種培養(yǎng)基，即：8. 6-BA 0.5 mg·L-1、9. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1、10. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、11. 6-BA 0.5 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1。

將按規(guī)格要求剪切的莖段分別接種到激素配比不同的5種培養(yǎng)基，即：12. 6-BA 0.2 mg·L-1、13.6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1、14. 6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1、15. 6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1、16. 0 mg·L-1(無激素)。

1.2.5 葉片誘導(dǎo)再生植株 取無菌苗葉片剪切成0.5～1 cm2，每片葉剪傷2處，分別接種于激素配比的5種培養(yǎng)基，即：17. 6-BA 0.01 mg·L-1+2,4D 0.01 mg·L-1、18. 2,4D 0.01 mg·L-1、19. IBA 0.01 mg·L-1、20. NAA 0.01 mg·L-1。

1.2.6 再生植株的獲得 莖段或愈傷組織誘導(dǎo)的叢生芽，待芽長至3 cm高時(shí)，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基形成再生植株。

1.2.7 數(shù)據(jù)的調(diào)查統(tǒng)計(jì)

(1)待種子萌發(fā)后一個(gè)星期內(nèi)統(tǒng)計(jì)枸杞發(fā)芽率和污染率。

種子萌發(fā)率=發(fā)芽種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100%

污染率=污染的瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100%

(2)觀察記錄愈傷組織的生長情況，統(tǒng)計(jì)黑果枸杞外植體的愈傷量、出愈率和生長狀況。

出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

愈傷量：++++表示愈傷組織體積是接種外植體的15-25倍；+++表示愈傷組織體積是接種外植體的10-20倍；++表示愈傷組織體積是接種外植體的5-10倍；+表示愈傷組織體積是接種外植體的0-5倍；

(3)觀察記錄叢生芽的生長情況，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基對(duì)黑果枸杞愈傷組織或莖段誘導(dǎo)分化叢生芽的影響，篩選誘導(dǎo)率高且叢生芽質(zhì)量好的最佳培養(yǎng)基。統(tǒng)計(jì)黑果枸杞叢生芽數(shù)、整齊度和增殖系數(shù)。

叢生芽數(shù)為接種的外植體上長出的芽個(gè)數(shù)；

整齊度：用差和齊表示，接種的外植體分化出的芽生長的高度一致即為齊，接種的外植體分化出的芽生長的高度不一致即為差；

增殖系數(shù)=增殖的芽數(shù)/接種數(shù)。

(4)觀察記錄葉片的生長情況，篩選葉片誘導(dǎo)率高且植株生長狀況最好的最佳培養(yǎng)基及其激素配比。統(tǒng)計(jì)葉片分化率。

葉片分化率=產(chǎn)生的植株數(shù)/接種葉片總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

將黑果枸杞無菌苗的葉片和莖段剪切2-3個(gè)傷口后接種到表1的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)室培養(yǎng)3-5 d后，莖段基部傷口處逐漸脫分化出現(xiàn)愈傷組織，呈緊密顆粒狀。葉片約7 d后變黃，傷口處逐漸脫分化形成愈傷組織，呈疏松顆粒狀。兩種外植體形成的愈傷組織15 d左右開始逐漸增多，45 d左右，愈傷組織量達(dá)到最大。無論用葉片，還是莖段做外植體，1-4號(hào)處理愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%；5號(hào)處理愈傷組織誘導(dǎo)率均為0；6號(hào)處理用葉片做外植體愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，莖段做外植體愈傷組織誘導(dǎo)率為25%；7號(hào)處理均有所下降(見表1)。

由表1可知，無論用葉片，還是莖段做外植體，低濃度的2,4-D能誘導(dǎo)出愈傷組織，并且隨著濃度的增加，誘導(dǎo)效果增強(qiáng)，愈傷量明顯變多；處理6中IBA使葉片和莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷量少、愈傷組織上有芽的分化，而莖段有叢生芽發(fā)生；處理7中NAA誘導(dǎo)葉片、莖段形成了少量愈傷，愈傷組織上均有芽的分化，IBA 、NAA，誘導(dǎo)莖段形成愈傷組織效果最差，2,4-D有利于愈傷組織誘導(dǎo)。

由此可見，以2,4-D 0.4 mg·L-1誘導(dǎo)葉片形成的愈傷組織最佳，以培養(yǎng)基2,4-D 0.3 mg·L-1誘導(dǎo)莖段形成的愈傷組織最佳，愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%。

表1 激素處理對(duì)黑果枸杞愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 叢生芽誘導(dǎo)

2.2.1 利用愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽 將生長狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至表2的叢生芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，15 d左右，愈傷組織分化形成叢生芽，表面分布少量綠色叢生芽點(diǎn)；30 d左右，愈傷組織上的大部分綠色叢生芽點(diǎn)開始分化形成叢生芽(見表2)。

表2為90 d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由表可知，當(dāng)KT濃度為0，6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，黑果枸杞叢生芽的增殖效果最好，增值系數(shù)為47.1倍。KT對(duì)叢生芽的分化沒有顯著的影響。

2.2.2 利用莖段誘導(dǎo)叢生芽 將黑果枸杞無菌苗的莖段接種到表3的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3-5 d后，莖段分化叢芽，且生長快速。15 d左右，莖段基部開始分化出大量幼芽組織團(tuán)塊。表3為60 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果，不同激素及其濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)黑果枸杞莖段誘導(dǎo)分化形成叢生芽有一定的影響。處理12芽增殖系數(shù)低，整齊度差；處理13和15雖然誘導(dǎo)的芽增殖系數(shù)高，但整齊度差；處理14，叢生芽整齊度好，增殖系數(shù)為32.3倍；處理16中不含激素，叢生芽誘導(dǎo)率為0；處理14的整體誘導(dǎo)叢生芽效果優(yōu)于其它處理。

2.3 利用葉片誘導(dǎo)再生植株

將規(guī)格為0.5～1 cm2的葉片接種至表4的培養(yǎng)基中。表4為40 d記錄結(jié)果。由表4可知處理17、 18有愈傷組織形成，無再生植株形成；其余2種處理在葉片傷口的主葉脈處均形成了芽，處理19生根率為33.3%，植株再生誘導(dǎo)率26.6%；處理20生根率為66.7%，植株再生誘導(dǎo)率33.3%。 由此可見，處理19， 0.01 mg·L-1的NAA誘導(dǎo)葉片形成再植株的效果較好，誘導(dǎo)率為33.3%。

表2 激素處理對(duì)愈傷組織形成叢生芽的影響

表3 激素處理對(duì)莖段誘導(dǎo)叢生芽的影響

表4 激素處理對(duì)葉片誘導(dǎo)植株的影響

2.4 生根培養(yǎng)

叢生芽高度長至3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d均可長出3-4條根，幼苗生長健壯(見圖1)。

3 討 論

3.1 黑果枸杞的葉和莖段較易誘導(dǎo)愈傷組織

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以葉和莖段為外植體時(shí)，在MS培養(yǎng)基上，添加2,4-D 0.1-0.4 mg·L-1均易誘導(dǎo)出愈傷組織，但I(xiàn)BA 、NAA，不利于誘導(dǎo)愈傷組織。冀菲[13]利用黑果枸杞剪掉根系的無菌苗在 MS+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中可以形成較好的愈傷組織, 其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)不同。此外，本實(shí)驗(yàn)在低激素MS+6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1培養(yǎng)基中形成的是叢生芽，其結(jié)果的不同可能與品種和光照時(shí)間不同有關(guān)。

圖1 MS培養(yǎng)基植株生根效果Fig.1 Rooting effect of plants in MS medium

3.2 選擇適宜的外植體有利于叢生芽誘導(dǎo)

愈組誘導(dǎo)叢生芽的過程中，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，可能由于細(xì)胞分裂素含量高，導(dǎo)致增殖系數(shù)太高，迫使叢生芽生長的過程中在營養(yǎng)需求量大，代謝物積累增多和生長空間不足，對(duì)生長產(chǎn)生了不利影響。本實(shí)驗(yàn)光照時(shí)間為15h，曹有龍等[16]認(rèn)為紅果枸杞的適宜光照時(shí)間為12 h，培養(yǎng)瓶內(nèi)濕度過大，凝結(jié)成小水滴后可能都提高了玻璃化發(fā)生率，因此，不建議利用愈組誘導(dǎo)叢生芽這種途徑。冀菲[13]認(rèn)為6-BA 高于0.6 mg·L-1時(shí)增殖率開始下降；當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA 質(zhì)量濃度為0. 4 mg·L-1時(shí)增殖效果最好，本實(shí)驗(yàn)篩選出6-BA 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)增殖效果最好, 與冀菲實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，而冀菲未提到玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。利用莖段誘導(dǎo)叢生芽的過程中，與愈組誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)條件相同，但未發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。Sun[14]等認(rèn)為利用黑果枸杞幼苗莖段為外植體時(shí)，使用6-BA易產(chǎn)生玻璃化苗，但本實(shí)驗(yàn)中采用了6-BA 0.2 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1和6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1激素配比沒有產(chǎn)生玻璃化苗，且繁殖系數(shù)高達(dá)32倍之多，可能是組培品種不同所致。

3.3 利用葉片直接誘導(dǎo)再生植株

郭輝[17]認(rèn)為紅果枸杞葉片不能分化產(chǎn)生芽。馬和平等[18]以“寧杞 2 號(hào)”葉片為試材，研究了其再生體系，認(rèn)為紅果枸杞直接從葉片上可分化產(chǎn)生芽，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于品種不同激素搭配不同，黑果枸杞在單獨(dú)使用IBA 0.01 mg·L-1和NAA 0.01 mg·L-1的培養(yǎng)基上，葉片首先在主葉脈傷口處長出根系，待根系長到一定長度后，葉片不經(jīng)過脫分化的過程，直接生成再生植株，也可按馬和平等方法將苗切下進(jìn)行生根。這個(gè)現(xiàn)象初步說明了黑果枸杞葉片的再生能力較強(qiáng)，此途徑為植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。