• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    sucA缺失型大腸桿菌菌株的構(gòu)建與發(fā)酵條件優(yōu)化

    2018-10-23 01:33:50張震宇孫付保
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)量優(yōu)化

    林 凡 , 張震宇 , 孫付保 *, 于 林

    (1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122;3.糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫214122)

    反式-4-羥脯氨酸屬于不常見(jiàn)的氨基酸,其在醫(yī)藥、美容、化工、食品等領(lǐng)域均具有重要作用[1-3],故近年來(lái)對(duì)其研究愈發(fā)增多。羥脯氨酸最初是在特定的蛋白中發(fā)現(xiàn)的,如膠原蛋白、肽類(lèi)抗生素(放線菌素、綠灰菌素)[4],目前主要是從動(dòng)物膠原蛋白中分離提取獲得[5],但由于該方法需要復(fù)雜的純化過(guò)程并會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物[6],所以研究酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)羥脯氨酸具有現(xiàn)實(shí)必要性。

    putA編碼的PutA蛋白具有脯氨酸脫氫酶和吡咯啉-5-羧酸脫氫酶雙重功能,在E.coli細(xì)胞中,該蛋白可以催化脯氨酸氧化生成谷氨酸,使得細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸積累量減少,不利于羥脯氨酸的生成。敲除putA基因可以有效提高由脯氨酸向羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率[7]。在TCA循環(huán)中,α-酮戊二酸脫氫酶催化α-酮戊二酸到琥珀酸的過(guò)程[8-9],sucA基因編碼的是α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的E1亞基,敲除該基因可以使α-酮戊二酸脫氫酶活性喪失[10]。而來(lái)自于指孢囊菌并已進(jìn)行密碼子優(yōu)化的反式-4-羥化酶基因(hyp)編碼的酶可以將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸[1,6],同時(shí)將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸。利用此特點(diǎn),以羥化酶基因取代sucA基因,使得菌株在生長(zhǎng)的同時(shí)可以積累反式-4-羥脯氨酸。在此過(guò)程中,反式-4-羥脯氨酸的積累與細(xì)胞的生長(zhǎng)相互偶聯(lián)。此外,編碼透明顫菌血紅蛋白(VHb)的vgb基因可以通過(guò)提高氧氣的傳遞而增強(qiáng)呼吸作用和能量代謝[11-12],故在質(zhì)粒上引入該基因?qū)τ陂L(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程較為有利。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種與質(zhì)粒 E.coli BL21(DE3)ΔputA為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pUC19-ptrp2-hyp-vgb(簡(jiǎn)稱(chēng)pUHVT4)為實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的,質(zhì)粒pET21a、pKD4為本實(shí)驗(yàn)室所有,質(zhì)粒pKD46由他人惠贈(zèng),T載(pUCm-T)購(gòu)自上海生工。

    1.1.2 試劑與酶 實(shí)驗(yàn)中涉及的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker購(gòu)自Takara(大連寶生物),Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶購(gòu)自上海生工。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自上海生工。其他的生化試劑購(gòu)自國(guó)藥。

    1.1.3 引物 引物H1和H2用于合成sucA基因的上游同源臂,P1和P2用于合成卡那抗性基因(kan),引物H3和H4用于合成sucA基因的下游同源臂,同源臂選用長(zhǎng)同源臂,引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[13]。其中,引物 H1的 5′端帶有 Nde I酶切位點(diǎn),H4的5′端帶有Xho I酶切位點(diǎn),用于基因片段與載體的連接;引物H2帶有Hind III和BamH I酶切位點(diǎn),用于羥化酶基因的插入;引物H2和P1、P2和H3反向互補(bǔ),用于基因片段的融合。上述引物均由上海生工合成。

    表1 研究中用到的引物Table 1 Primers used in the research

    1.2 方法

    1.2.1 含有打靶片段載體的構(gòu)建 擴(kuò)增獲得sucA基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因,將三者以摩爾比1∶1∶1進(jìn)行混合,以H1和H4為引物,擴(kuò)增獲得3個(gè)基因片段的融合片段[14-15]。將融合片段與T載(pUCm-T)以 7∶1~10∶1 的比例混合,用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后導(dǎo)入E.coli JM109,載體命名為pUCm-T-AK,連接體系和條件參照Takara說(shuō)明書(shū)。之后用Xho I和Nde I雙酶切載體pUCm-T-AK獲得含有酶切位點(diǎn)的融合片段,與同樣雙酶切的pET21a進(jìn)行連接,載體命名為pET21a-AK。Hind III和BamH I雙酶切質(zhì)粒pUHVT4獲得hyp基因,與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET21a-AK進(jìn)行連接,載體命名為pET21a-AKH,從而獲得含有打靶片段的載體。

    1.2.2 sucA基因敲除菌的獲得 本次基因敲除是基于Red重組系統(tǒng)進(jìn)行的,具體實(shí)施步驟參考文獻(xiàn)[16-18]。

    1.2.3 發(fā)酵液中羥脯氨酸的測(cè)定 采用比色法測(cè)定發(fā)酵液中的羥脯氨酸含量,反應(yīng)原理與具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[19]。

    1.2.4 初步篩選高產(chǎn)菌株 將質(zhì)粒pUHVT4轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA 的轉(zhuǎn)化子中,35 ℃,220 r/min進(jìn)行發(fā)酵 ,比色法測(cè)定羥脯氨酸的產(chǎn)量,將最為高產(chǎn)的菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。提取該菌株的基因組,以Y1和H4為引物,PCR獲得打靶片段所在的基因片段,并測(cè)序。

    1.2.5 全細(xì)胞酶活測(cè)定 在平板上劃線后,挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12 h,測(cè)定菌的全細(xì)胞酶活,測(cè)定方法參考[1,4]。其中,1個(gè)單位酶活的定義為:1 min催化反應(yīng)得到1 μmol反式-4-羥脯氨酸的酶量,單位為U;全細(xì)胞酶活為每g干菌體的酶活,單位為U/DCW。

    1.2.6 重組菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 種子培養(yǎng):挑取活 化 后 的 E.coliBL21 (DE3)ΔputAΔsucA(pUHVT4)單菌落接種到含有抗生素的30 mL(250 mL錐形瓶)LB培養(yǎng)基中,37℃,220 r/min培養(yǎng)8 h。發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以6%的接種量接入30 mL(250 mL錐形瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中,35℃,220 r/min培養(yǎng)12 h。在搖瓶水平優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組分與發(fā)酵條件下,確定較優(yōu)的培養(yǎng)基組分。 包括葡萄糖(0、2、4、8、12、16 g/L)和甘油(0、3、6、10、14 g/L)、玉米漿(8、12、16、20、24 g/L)、K2HPO4(1.5、9、11、14、17、25 g/L)、(NH4)2SO4(0、3、8、13、17、21 g/L)和 FeSO4濃度 (0、1、2、3、4 mmol/L) 以及 pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5),之后進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 sucA基因的上、下游同源臂、卡那抗性基因以及融合片段的獲得

    以提取的E.coli BL21(DE3)的基因組為模板,以H1、H2和H3、H4為引物,PCR獲得sucA基因的548 bp的上游同源臂和591 bp的下游同源臂。以質(zhì)粒pKD4為模板,以P1和P2為引物,獲得大小為1 521 bp的kan基因片段(圖1)。三者混合,PCR獲得大小為2.6 kb的片段。

    圖1 基因敲除用PCR片段的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis maps of PCR products for gene deletion

    2.2 含有打靶片段的載體構(gòu)建

    重組質(zhì)粒pUCm-T-AK,用引物H1和H4作為驗(yàn)證引物,以提取的質(zhì)粒為模板,PCR獲得大小為2.6 kb的條帶為正確質(zhì)粒。質(zhì)粒pET21a-AK用Hind III單酶切獲得大小為8 049 bp的條帶,Xho I和Hind III得到大小分別為2 093 bp和5 956 bp的兩條條帶,凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖2。

    2.3 E.coli△putA菌株的sucA基因敲除

    以提取的質(zhì)粒pET21a-AKH為模板,以H1和H4為引物,獲得大小為3.4 kb的打靶片段。電轉(zhuǎn)后的轉(zhuǎn)化子以引物Y1和P2作為驗(yàn)證引物,在NCBI里將該引物與E.coli BL21(DE3)的基因組比對(duì)后沒(méi)有條帶,缺失菌經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增則獲得大小為3 kb的電泳條帶。驗(yàn)證正確的 E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA(BPAP)轉(zhuǎn)化子有 4個(gè),分別導(dǎo)入質(zhì)粒pUHVT4。初始脯氨酸濃度為8 mmol/L,發(fā)酵12 h的發(fā)酵結(jié)果如圖3所示,選用羥脯氨酸產(chǎn)量最高的3號(hào)菌株作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。提取3號(hào)菌株的基因組,以Y1和H4為引物進(jìn)行PCR,將獲得的PCR片段進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,羥化酶基因成功重組到基因組上。

    圖2 pET21a-AK單、雙酶切Fig.2 Double digests of pET21a-AK

    圖3 4個(gè)轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Fermentation results of converters

    2.4 各種菌株的全細(xì)胞酶活測(cè)定

    測(cè)定 E.coli BL21 (DE3)、E.coli BL21(DE3)(pUHVT4)、E.coli BL21(DE3)ΔputA(pUHVT4)、E.coli (DE3)ΔsucA (pUHVT4)、E.coli BL21 (DE3)ΔputAΔsucA(pUHVT4)五株菌株的全細(xì)胞酶活,結(jié)果見(jiàn)圖4。從測(cè)定結(jié)果看,菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA(pUHVT4)的全細(xì)胞酶活最高,其次是E.coli BL21(DE3)ΔsucA(pUHVT4)和 E.coli BL21(DE3)ΔputA (pUHVT4), 均高于原菌 E.coli BL21(DE3)(pUHVT4),說(shuō)明不論單基因敲除還是雙基因敲除均有利于提高細(xì)胞的全細(xì)胞酶活。其次,E.coli BL21(DE3)ΔsucA(pUHVT4)的全細(xì)胞酶活高于菌 E.coli BL21(DE3)ΔputA(pUHVT4),說(shuō)明從全細(xì)胞酶活來(lái)看,敲除基因sucA后的產(chǎn)羥脯氨酸的效果要好于敲除基因putA。而菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA(pUHVT4)的全細(xì)胞酶活高于任何一個(gè)單敲除菌,說(shuō)明兩個(gè)基因的敲除效果是相互疊加的卻又不是簡(jiǎn)單的相加效果。

    圖4 不同菌株的全細(xì)胞酶活Fig.4 Whole cell activity of strains

    2.5 發(fā)酵單因素優(yōu)化

    2.5.1 碳源對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 在不加甘油的前提下,對(duì)葡萄糖的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。從圖5來(lái)看,不加葡萄糖時(shí),OD600與羥脯氨酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于其他濃度,但是羥脯氨酸的產(chǎn)量也在160 mg/L左右,分析原因可能是:發(fā)酵用的玉米漿中含有還原糖,可以為微生物提供少量的碳源。葡萄糖質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)的OD600遠(yuǎn)高于不加葡萄糖,但在高于2 g/L之后便沒(méi)有明顯的變化,而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在葡萄糖質(zhì)量濃度為4g/L時(shí)達(dá)到了最高值。在葡萄糖添加質(zhì)量濃度為4 g/L的條件下,優(yōu)化甘油的濃度。從圖6來(lái)看,甘油質(zhì)量濃度對(duì)OD600沒(méi)有明顯的影響,而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在甘油質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)達(dá)到了最大值。

    2.5.2 氮源對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 玉米漿中富含多肽、多糖、亞硫酸、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸,這些成分多作為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的前提物質(zhì)。在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中除了作為氮源,玉米漿中的生長(zhǎng)因子尤其是生物素對(duì)氨基酸的生產(chǎn)也有促進(jìn)作用,故以玉米漿作為發(fā)酵有機(jī)氮源,成本低廉并且有效[20]。從圖7來(lái)看,玉米漿的添加有利于菌體的生長(zhǎng),在低于20 g/L時(shí)有利于羥脯氨酸的生成,但添加量高于20 g/L時(shí),羥脯氨酸的產(chǎn)量不但沒(méi)有提高,反而有所下降。最終優(yōu)化后,將最適的玉米漿質(zhì)量濃度定為20 g/L。

    圖5 葡萄糖對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of glucose on trans-4-hydroxyproline

    圖6 甘油對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of glycerol on trans-4-hydroxyproline

    圖7 玉米漿對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effectofcorn steep liquor on trans-4-hydroxyproline

    2.5.3 K2HPO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響對(duì)K2HPO4的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)其對(duì)羥脯氨酸產(chǎn)量的影響最為顯著。從圖8來(lái)看,在K2HPO4的質(zhì)量濃度低于17 g/L時(shí),OD600隨著K2HPO4的添加逐漸升高,當(dāng)質(zhì)量濃度高于17 g/L時(shí),OD600有所下降。而羥脯氨酸的產(chǎn)量在質(zhì)量濃度為11 g/L時(shí)達(dá)到了最高值,由初始培養(yǎng)基的216 mg/L達(dá)到了753 mg/L。分析原因:K2HPO4為微生物的生長(zhǎng)與氨基酸的發(fā)酵提供磷、鉀元素;同時(shí),K2HPO4水溶液呈微堿性,可以與酸性物質(zhì)反應(yīng)生成KH2PO4,KH2PO4則與堿性物質(zhì)反應(yīng)生成 K2HPO4,K2HPO4與KH2PO4的酸堿性均不強(qiáng),可以將發(fā)酵體系的pH維持在較為穩(wěn)定的范圍。

    圖8 K2HPO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of K2HPO4on trans-4-hydroxyproline

    2.5.4 (NH4)2SO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響發(fā)酵過(guò)程中,(NH4)2SO4既可以作為無(wú)機(jī)氮源,同時(shí)NH4+是一種較好的緩沖離子,在某種程度上可以調(diào)節(jié)pH。其質(zhì)量濃度對(duì)羥脯氨酸產(chǎn)量的影響如圖9所示,在(NH4)2SO4質(zhì)量濃度低于 17 g/L 時(shí),OD600隨著 (NH4)2SO4的添加而升高,當(dāng)添加質(zhì)量濃度高于17 g/L時(shí),OD600開(kāi)始下降。而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為13 g/L時(shí)達(dá)到了最高值。

    圖9 (NH4)2SO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of(NH4)2SO4on trans-4-hydroxyproline

    2.5.5 FeSO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 脯氨酸羥基化生成羥脯氨酸的過(guò)程是由反式-4-羥化酶催化的,而反式-4-羥化酶屬于2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶家族,該酶的催化過(guò)程需要Fe2+的參與[6]。從圖10來(lái)看,OD600隨著FeSO4濃度的升高而升高,也就是說(shuō),適量的添加亞鐵離子有利于菌體的生長(zhǎng)。當(dāng)不添加FeSO4時(shí),仍有較高的羥脯氨酸產(chǎn)量,可能是由于玉米漿中含有一定濃度的鐵元素。最終優(yōu)化結(jié)果表明,羥脯氨酸的產(chǎn)量在FeSO4濃度為1 mmol/L時(shí)達(dá)到了最高值。

    圖10 FeSO4對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of FeSO4on trans-4-hydroxyproline

    3.5.6 pH對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH會(huì)直接影響菌株的生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)[21],隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行,培養(yǎng)基成分的改變和微生物的代謝產(chǎn)物都會(huì)使pH發(fā)生極大變化。從圖11來(lái)看,隨著初始pH的增大,菌體OD600有所升高,但當(dāng)pH到9.5時(shí),菌體的生長(zhǎng)受到極大的抑制,幾乎不能夠進(jìn)行生長(zhǎng)。而羥脯氨酸的積累量隨著pH的增大而逐漸升高,在pH為8.5時(shí)達(dá)到了最大值,之后迅速下降。表明,過(guò)堿的環(huán)境會(huì)嚴(yán)重抑制菌的生長(zhǎng)與羥脯氨酸的產(chǎn)生。

    圖11 pH對(duì)反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of pH on trans-4-hydroxyproline

    3.5.7 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素優(yōu)化的結(jié)果,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),正交因素和水平以及正交結(jié)果分別如表2和表3所示。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors level of orthogonal experiment

    表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

    由表中的極差得到因素的主次順序依次為:(NH4)2SO4(E)>玉米漿(C)>Fe2+(G)>葡萄糖(A)>甘油(B)>K2HPO4(D)>NaCl(F),得到的最佳組合:A2B3C1D2E1F1G2,即葡萄糖 4 g/L,甘油 10 g/L,玉米漿16 g/L,K2HPO411 g/L,(NH4)2SO4 8 g/L,NaCl 0.75 g/L,MgSO40.3 g/L,CaCl20.005 g/L,F(xiàn)eSO41 mmol/L。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證:同樣培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)基優(yōu)化前的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.28 g/L,培養(yǎng)基優(yōu)化后的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為1.08 g/L,是優(yōu)化前的3.87倍。

    3 結(jié) 語(yǔ)

    本文在 E.coli BL21(DE3)ΔputA 的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步敲除了基因sucA并在基因組上引入羥化酶基因(hyp)。但由于基因組上的表達(dá)量不夠高,故導(dǎo)入輔助質(zhì)粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb,其中,vgb基因能夠提高細(xì)胞的溶氧,對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程較為有利。實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行菌株 E.coli BL21(DE3)(pUHVT4)的培養(yǎng)基優(yōu)化,在初始脯氨酸400 mmol/L,發(fā)酵24 h后的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.97 g/L。而構(gòu)建的突變菌優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后,在初始L-脯氨酸為100 mmol/L,發(fā)酵12 h時(shí)的產(chǎn)量為1.08 g/L,相比較而言,雙敲除菌 E.coli BL21(DE3)ΔputAΔsucA(pUHVT4)具有明顯優(yōu)勢(shì),不僅縮短了發(fā)酵時(shí)間,而且提高了脯氨酸的轉(zhuǎn)化率。

    接下來(lái)需在搖瓶?jī)?yōu)化的基礎(chǔ)上,進(jìn)行發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn),通過(guò)流加葡萄糖,維持重組大腸桿菌的持續(xù)生長(zhǎng)從而不斷積累反式-4-羥脯氨酸,為工業(yè)化生產(chǎn)做準(zhǔn)備。

    猜你喜歡
    產(chǎn)量優(yōu)化
    超限高層建筑結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化思考
    2022年11月份我國(guó)鋅產(chǎn)量同比增長(zhǎng)2.9% 鉛產(chǎn)量同比增長(zhǎng)5.6%
    提高玉米產(chǎn)量 膜下滴灌有效
    民用建筑防煙排煙設(shè)計(jì)優(yōu)化探討
    關(guān)于優(yōu)化消防安全告知承諾的一些思考
    一道優(yōu)化題的幾何解法
    由“形”啟“數(shù)”優(yōu)化運(yùn)算——以2021年解析幾何高考題為例
    世界致密油產(chǎn)量發(fā)展趨勢(shì)
    海水稻產(chǎn)量測(cè)評(píng)平均產(chǎn)量逐年遞增
    2018年我國(guó)主要水果產(chǎn)量按?。▍^(qū)、市)分布
    91老司机精品| 夫妻午夜视频| 大片电影免费在线观看免费| 午夜日韩欧美国产| 亚洲 国产 在线| 国产成人系列免费观看| 午夜福利一区二区在线看| 天天添夜夜摸| 五月开心婷婷网| 十八禁人妻一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲色图综合在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线永久观看黄色视频| 色尼玛亚洲综合影院| 色综合婷婷激情| 丝袜在线中文字幕| 欧美午夜高清在线| 在线观看午夜福利视频| 国产片内射在线| a级毛片黄视频| 91成人精品电影| 女人久久www免费人成看片| 国产精品成人在线| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一卡二卡三卡精品| 又大又爽又粗| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产三级黄色录像| 女警被强在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 999久久久精品免费观看国产| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99国产综合亚洲精品| 欧美色视频一区免费| 最新美女视频免费是黄的| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久狼人影院| 一级片免费观看大全| 精品欧美一区二区三区在线| 曰老女人黄片| avwww免费| 天堂中文最新版在线下载| 国产麻豆69| av国产精品久久久久影院| 999久久久精品免费观看国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲五月婷婷丁香| 人人澡人人妻人| 国产视频一区二区在线看| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 黄色女人牲交| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 一级a爱视频在线免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产av精品麻豆| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成年动漫av网址| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲精华国产精华精| 婷婷丁香在线五月| 不卡av一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜日韩欧美国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品av久久久久免费| 极品人妻少妇av视频| 色综合婷婷激情| av线在线观看网站| 一个人免费在线观看的高清视频| 极品人妻少妇av视频| 在线国产一区二区在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲免费av在线视频| 91在线观看av| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品一区二区在线不卡| 手机成人av网站| 国产一区在线观看成人免费| a在线观看视频网站| 国产激情久久老熟女| 水蜜桃什么品种好| 宅男免费午夜| 男人操女人黄网站| 亚洲av片天天在线观看| 免费少妇av软件| 中文字幕人妻丝袜制服| svipshipincom国产片| 激情在线观看视频在线高清 | 伦理电影免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 在线观看日韩欧美| 美国免费a级毛片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美日韩黄片免| 99国产极品粉嫩在线观看| av在线播放免费不卡| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产成人影院久久av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 校园春色视频在线观看| 色播在线永久视频| 不卡一级毛片| 美女午夜性视频免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久亚洲真实| 亚洲精品乱久久久久久| 黄色毛片三级朝国网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 好男人电影高清在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 九色亚洲精品在线播放| 岛国毛片在线播放| 亚洲综合色网址| 少妇 在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 操出白浆在线播放| 91九色精品人成在线观看| 午夜影院日韩av| 天天操日日干夜夜撸| 黑人猛操日本美女一级片| 激情视频va一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 成年女人毛片免费观看观看9 | 捣出白浆h1v1| 成人国语在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品国产高清国产av | 在线播放国产精品三级| 免费在线观看影片大全网站| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久中文字幕一级| 国产高清国产精品国产三级| 成人av一区二区三区在线看| 极品教师在线免费播放| 成人影院久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲av熟女| 精品第一国产精品| 亚洲少妇的诱惑av| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄色a级毛片大全视频| av线在线观看网站| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产成人免费无遮挡视频| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 搡老乐熟女国产| 亚洲专区中文字幕在线| 一级片免费观看大全| 欧美最黄视频在线播放免费 | 宅男免费午夜| 成人国语在线视频| 国产视频一区二区在线看| 久久久国产精品麻豆| 老司机福利观看| 亚洲中文字幕日韩| 免费观看人在逋| 国产人伦9x9x在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产欧美网| 一区福利在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 女性被躁到高潮视频| 99热只有精品国产| 中出人妻视频一区二区| 日本黄色视频三级网站网址 | 黄色成人免费大全| 天天添夜夜摸| 精品一区二区三区av网在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲,欧美精品.| 久久这里只有精品19| 曰老女人黄片| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲情色 制服丝袜| 99久久人妻综合| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人精品一区二区免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品久久久久久精品古装| 久久中文字幕一级| 国精品久久久久久国模美| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久性视频一级片| 手机成人av网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品国内亚洲2022精品成人 | bbb黄色大片| 激情在线观看视频在线高清 | 热99国产精品久久久久久7| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲伊人色综图| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久热爱精品视频在线9| 国产精品一区二区在线观看99| www.熟女人妻精品国产| 在线视频色国产色| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲中文av在线| 国产精品久久电影中文字幕 | 大香蕉久久成人网| 亚洲专区字幕在线| 国产一区二区激情短视频| 国产激情久久老熟女| www.自偷自拍.com| 欧美成狂野欧美在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费观看精品视频网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 很黄的视频免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲黑人精品在线| 美女福利国产在线| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 超色免费av| 国产精品久久久久成人av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 国产主播在线观看一区二区| 免费不卡黄色视频| 亚洲专区中文字幕在线| 成人手机av| 成年人午夜在线观看视频| videosex国产| 免费在线观看日本一区| 亚洲第一青青草原| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 丁香欧美五月| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 免费观看a级毛片全部| av免费在线观看网站| 极品教师在线免费播放| 丝袜美足系列| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美老熟妇乱子伦牲交| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲伊人色综图| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜两性在线视频| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲一区中文字幕在线| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲av熟女| 在线观看免费高清a一片| 亚洲第一青青草原| 国产高清videossex| 男人操女人黄网站| 岛国在线观看网站| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美激情高清一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久国产精品影院| 日本黄色日本黄色录像| 91麻豆av在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 99国产综合亚洲精品| 国产高清国产精品国产三级| av天堂在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕高清在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 天天影视国产精品| 久久九九热精品免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 啦啦啦免费观看视频1| 丝袜人妻中文字幕| 窝窝影院91人妻| 一区福利在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 麻豆成人av在线观看| cao死你这个sao货| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久中文字幕一级| 国产在视频线精品| 国产有黄有色有爽视频| 午夜福利影视在线免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 咕卡用的链子| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 香蕉久久夜色| 免费观看人在逋| 久久精品国产综合久久久| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 十八禁网站免费在线| xxx96com| 久久久久精品人妻al黑| 一级毛片精品| 午夜福利免费观看在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产三级黄色录像| 色播在线永久视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜福利欧美成人| 老司机福利观看| 在线观看一区二区三区激情| 大码成人一级视频| 久久狼人影院| 校园春色视频在线观看| 两个人免费观看高清视频| 成人三级做爰电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产欧美日韩一区二区三| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲片人在线观看| 久久久国产一区二区| 美女午夜性视频免费| 欧美一级毛片孕妇| 午夜福利乱码中文字幕| 成人影院久久| 91精品三级在线观看| 国产成人av激情在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久精品人妻al黑| 男男h啪啪无遮挡| 成人亚洲精品一区在线观看| 香蕉久久夜色| 久久99一区二区三区| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲七黄色美女视频| www日本在线高清视频| 一夜夜www| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲av熟女| 下体分泌物呈黄色| 国产精品久久视频播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 大香蕉久久成人网| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 老鸭窝网址在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美精品亚洲一区二区| 高清毛片免费观看视频网站 | 十八禁高潮呻吟视频| 操美女的视频在线观看| 精品一区二区三卡| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品第一国产精品| 国产精品九九99| 在线国产一区二区在线| 午夜亚洲福利在线播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲专区国产一区二区| 制服诱惑二区| av线在线观看网站| 777米奇影视久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美精品av麻豆av| www.999成人在线观看| 丁香六月欧美| 欧美激情高清一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 超色免费av| 美女视频免费永久观看网站| 精品久久久久久电影网| 搡老岳熟女国产| 午夜成年电影在线免费观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费在线观看日本一区| 成在线人永久免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 夜夜爽天天搞| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线观看66精品国产| 超色免费av| 悠悠久久av| 精品久久久久久电影网| 国产一区在线观看成人免费| 制服人妻中文乱码| 五月开心婷婷网| 香蕉久久夜色| 亚洲国产欧美一区二区综合| 超碰97精品在线观看| 一进一出抽搐动态| 搡老岳熟女国产| www.熟女人妻精品国产| 一二三四社区在线视频社区8| 一级毛片高清免费大全| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 波多野结衣一区麻豆| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲成国产人片在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av电影在线进入| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成年人黄色毛片网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久国产成人精品二区 | av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲第一av免费看| 精品第一国产精品| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品二区激情视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 天天操日日干夜夜撸| av视频免费观看在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 黄色视频,在线免费观看| 下体分泌物呈黄色| 一区在线观看完整版| av中文乱码字幕在线| 国产精品免费大片| 亚洲熟妇熟女久久| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产黄色免费在线视频| 91字幕亚洲| 精品午夜福利视频在线观看一区| 高清视频免费观看一区二区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产亚洲一区二区精品| aaaaa片日本免费| 午夜福利欧美成人| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品av久久久久免费| 国产精品1区2区在线观看. | 少妇 在线观看| av福利片在线| 国产一区在线观看成人免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 香蕉丝袜av| 久久国产精品影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品av久久久久免费| 久热爱精品视频在线9| 操出白浆在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美最黄视频在线播放免费 | 大香蕉久久成人网| 男女午夜视频在线观看| 欧美大码av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产乱人伦免费视频| av福利片在线| 午夜福利欧美成人| 99精品在免费线老司机午夜| 在线看a的网站| 亚洲精品在线美女| 少妇的丰满在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲专区字幕在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 少妇的丰满在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线播放国产精品三级| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品1区2区在线观看. | 不卡一级毛片| 大码成人一级视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲国产精品sss在线观看 | 午夜福利影视在线免费观看| 久久性视频一级片| 国产精品久久久av美女十八| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 色综合婷婷激情| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品影院久久| 中文字幕最新亚洲高清| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看www视频免费| 亚洲免费av在线视频| 日韩欧美三级三区| av不卡在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产不卡一卡二| 国产精品电影一区二区三区 | 婷婷成人精品国产| 99久久综合精品五月天人人| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女国产高潮福利片在线看| 一进一出抽搐动态| 丰满的人妻完整版| 精品国产国语对白av| 免费看十八禁软件| 十八禁高潮呻吟视频| 精品第一国产精品| а√天堂www在线а√下载 | 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品美女久久av网站| 手机成人av网站| 美女 人体艺术 gogo| 18禁国产床啪视频网站| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产成人免费无遮挡视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费看a级黄色片| 91老司机精品| 69av精品久久久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 高清在线国产一区| 国产有黄有色有爽视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜两性在线视频| 大码成人一级视频| 国产精品.久久久| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲久久久国产精品| 手机成人av网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲综合色网址| 亚洲久久久国产精品| 香蕉久久夜色| 18在线观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 中文字幕高清在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 丝袜在线中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲在线自拍视频| 久久香蕉国产精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁人妻一区二区| 老熟女久久久| 欧美中文综合在线视频| 久久香蕉国产精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝袜美腿诱惑在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 不卡一级毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久久精品人妻al黑|