sucA缺失型大腸桿菌菌株的構(gòu)建與發(fā)酵條件優(yōu)化

林 凡 ， 張震宇 ， 孫付保 *， 于 林

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

反式-4-羥脯氨酸屬于不常見的氨基酸，其在醫(yī)藥、美容、化工、食品等領(lǐng)域均具有重要作用[1-3]，故近年來對其研究愈發(fā)增多。羥脯氨酸最初是在特定的蛋白中發(fā)現(xiàn)的，如膠原蛋白、肽類抗生素（放線菌素、綠灰菌素）[4]，目前主要是從動物膠原蛋白中分離提取獲得[5]，但由于該方法需要復(fù)雜的純化過程并會產(chǎn)生大量的廢棄物[6]，所以研究酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)羥脯氨酸具有現(xiàn)實(shí)必要性。

putA編碼的PutA蛋白具有脯氨酸脫氫酶和吡咯啉-5-羧酸脫氫酶雙重功能，在E.coli細(xì)胞中，該蛋白可以催化脯氨酸氧化生成谷氨酸，使得細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸積累量減少，不利于羥脯氨酸的生成。敲除putA基因可以有效提高由脯氨酸向羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率[7]。在TCA循環(huán)中，α-酮戊二酸脫氫酶催化α-酮戊二酸到琥珀酸的過程[8-9]，sucA基因編碼的是α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的E1亞基，敲除該基因可以使α-酮戊二酸脫氫酶活性喪失[10]。而來自于指孢囊菌并已進(jìn)行密碼子優(yōu)化的反式-4-羥化酶基因（hyp）編碼的酶可以將游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥脯氨酸[1，6]，同時(shí)將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸。利用此特點(diǎn)，以羥化酶基因取代sucA基因，使得菌株在生長的同時(shí)可以積累反式-4-羥脯氨酸。在此過程中，反式-4-羥脯氨酸的積累與細(xì)胞的生長相互偶聯(lián)。此外，編碼透明顫菌血紅蛋白（VHb）的vgb基因可以通過提高氧氣的傳遞而增強(qiáng)呼吸作用和能量代謝[11-12]，故在質(zhì)粒上引入該基因?qū)τ陂L時(shí)間的發(fā)酵過程較為有利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 E.coli BL21（DE3）ΔputA為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pUC19-ptrp2-hyp-vgb（簡稱pUHVT4）為實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的，質(zhì)粒pET21a、pKD4為本實(shí)驗(yàn)室所有，質(zhì)粒pKD46由他人惠贈，T載（pUCm-T）購自上海生工。

1.1.2 試劑與酶 實(shí)驗(yàn)中涉及的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker購自Takara（大連寶生物），Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶購自上海生工。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、胰蛋白胨和酵母提取物購自上海生工。其他的生化試劑購自國藥。

1.1.3 引物 引物H1和H2用于合成sucA基因的上游同源臂，P1和P2用于合成卡那抗性基因（kan），引物H3和H4用于合成sucA基因的下游同源臂，同源臂選用長同源臂，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[13]。其中，引物 H1的 5′端帶有 Nde I酶切位點(diǎn)，H4的5′端帶有Xho I酶切位點(diǎn)，用于基因片段與載體的連接；引物H2帶有Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)，用于羥化酶基因的插入；引物H2和P1、P2和H3反向互補(bǔ)，用于基因片段的融合。上述引物均由上海生工合成。

表1 研究中用到的引物Table 1 Primers used in the research

1.2 方法

1.2.1 含有打靶片段載體的構(gòu)建 擴(kuò)增獲得sucA基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因，將三者以摩爾比1∶1∶1進(jìn)行混合，以H1和H4為引物，擴(kuò)增獲得3個基因片段的融合片段[14-15]。將融合片段與T載（pUCm-T）以 7∶1～10∶1 的比例混合，用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后導(dǎo)入E.coli JM109，載體命名為pUCm-T-AK，連接體系和條件參照Takara說明書。之后用Xho I和Nde I雙酶切載體pUCm-T-AK獲得含有酶切位點(diǎn)的融合片段，與同樣雙酶切的pET21a進(jìn)行連接，載體命名為pET21a-AK。Hind III和BamH I雙酶切質(zhì)粒pUHVT4獲得hyp基因，與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET21a-AK進(jìn)行連接，載體命名為pET21a-AKH，從而獲得含有打靶片段的載體。

1.2.2 sucA基因敲除菌的獲得 本次基因敲除是基于Red重組系統(tǒng)進(jìn)行的，具體實(shí)施步驟參考文獻(xiàn)[16-18]。

1.2.3 發(fā)酵液中羥脯氨酸的測定 采用比色法測定發(fā)酵液中的羥脯氨酸含量，反應(yīng)原理與具體實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[19]。

1.2.4 初步篩選高產(chǎn)菌株 將質(zhì)粒pUHVT4轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA 的轉(zhuǎn)化子中，35 ℃，220 r/min進(jìn)行發(fā)酵 ，比色法測定羥脯氨酸的產(chǎn)量，將最為高產(chǎn)的菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對象。提取該菌株的基因組，以Y1和H4為引物，PCR獲得打靶片段所在的基因片段，并測序。

1.2.5 全細(xì)胞酶活測定 在平板上劃線后，挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，測定菌的全細(xì)胞酶活，測定方法參考[1，4]。其中，1個單位酶活的定義為：1 min催化反應(yīng)得到1 μmol反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U；全細(xì)胞酶活為每g干菌體的酶活，單位為U/DCW。

1.2.6 重組菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 種子培養(yǎng)：挑取活 化 后 的 E.coliBL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）單菌落接種到含有抗生素的30 mL（250 mL錐形瓶）LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)8 h。發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以6%的接種量接入30 mL（250 mL錐形瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，220 r/min培養(yǎng)12 h。在搖瓶水平優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組分與發(fā)酵條件下，確定較優(yōu)的培養(yǎng)基組分。 包括葡萄糖（0、2、4、8、12、16 g/L）和甘油（0、3、6、10、14 g/L）、玉米漿（8、12、16、20、24 g/L）、K2HPO4（1.5、9、11、14、17、25 g/L）、（NH4）2SO4（0、3、8、13、17、21 g/L）和 FeSO4濃度 （0、1、2、3、4 mmol/L） 以及 pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），之后進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 sucA基因的上、下游同源臂、卡那抗性基因以及融合片段的獲得

以提取的E.coli BL21（DE3）的基因組為模板，以H1、H2和H3、H4為引物，PCR獲得sucA基因的548 bp的上游同源臂和591 bp的下游同源臂。以質(zhì)粒pKD4為模板，以P1和P2為引物，獲得大小為1 521 bp的kan基因片段（圖1）。三者混合，PCR獲得大小為2.6 kb的片段。

圖1 基因敲除用PCR片段的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis maps of PCR products for gene deletion

2.2 含有打靶片段的載體構(gòu)建

重組質(zhì)粒pUCm-T-AK，用引物H1和H4作為驗(yàn)證引物，以提取的質(zhì)粒為模板，PCR獲得大小為2.6 kb的條帶為正確質(zhì)粒。質(zhì)粒pET21a-AK用Hind III單酶切獲得大小為8 049 bp的條帶，Xho I和Hind III得到大小分別為2 093 bp和5 956 bp的兩條條帶，凝膠電泳圖譜見圖2。

2.3 E.coli△putA菌株的sucA基因敲除

以提取的質(zhì)粒pET21a-AKH為模板，以H1和H4為引物，獲得大小為3.4 kb的打靶片段。電轉(zhuǎn)后的轉(zhuǎn)化子以引物Y1和P2作為驗(yàn)證引物，在NCBI里將該引物與E.coli BL21（DE3）的基因組比對后沒有條帶，缺失菌經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增則獲得大小為3 kb的電泳條帶。驗(yàn)證正確的 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（BPAP）轉(zhuǎn)化子有 4個，分別導(dǎo)入質(zhì)粒pUHVT4。初始脯氨酸濃度為8 mmol/L，發(fā)酵12 h的發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，選用羥脯氨酸產(chǎn)量最高的3號菌株作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)對象。提取3號菌株的基因組，以Y1和H4為引物進(jìn)行PCR，將獲得的PCR片段進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，羥化酶基因成功重組到基因組上。

圖2 pET21a-AK單、雙酶切Fig.2 Double digests of pET21a-AK

圖3 4個轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Fermentation results of converters

2.4 各種菌株的全細(xì)胞酶活測定

測定 E.coli BL21 （DE3）、E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）、E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4）、E.coli （DE3）ΔsucA （pUHVT4）、E.coli BL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）五株菌株的全細(xì)胞酶活，結(jié)果見圖4。從測定結(jié)果看，菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全細(xì)胞酶活最高，其次是E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）和 E.coli BL21（DE3）ΔputA （pUHVT4）， 均高于原菌 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4），說明不論單基因敲除還是雙基因敲除均有利于提高細(xì)胞的全細(xì)胞酶活。其次，E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）的全細(xì)胞酶活高于菌 E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4），說明從全細(xì)胞酶活來看，敲除基因sucA后的產(chǎn)羥脯氨酸的效果要好于敲除基因putA。而菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全細(xì)胞酶活高于任何一個單敲除菌，說明兩個基因的敲除效果是相互疊加的卻又不是簡單的相加效果。

圖4 不同菌株的全細(xì)胞酶活Fig.4 Whole cell activity of strains

2.5 發(fā)酵單因素優(yōu)化

2.5.1 碳源對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 在不加甘油的前提下，對葡萄糖的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。從圖5來看，不加葡萄糖時(shí)，OD600與羥脯氨酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于其他濃度，但是羥脯氨酸的產(chǎn)量也在160 mg/L左右，分析原因可能是：發(fā)酵用的玉米漿中含有還原糖，可以為微生物提供少量的碳源。葡萄糖質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)的OD600遠(yuǎn)高于不加葡萄糖，但在高于2 g/L之后便沒有明顯的變化，而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在葡萄糖質(zhì)量濃度為4g/L時(shí)達(dá)到了最高值。在葡萄糖添加質(zhì)量濃度為4 g/L的條件下，優(yōu)化甘油的濃度。從圖6來看，甘油質(zhì)量濃度對OD600沒有明顯的影響，而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在甘油質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)達(dá)到了最大值。

2.5.2 氮源對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 玉米漿中富含多肽、多糖、亞硫酸、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸，這些成分多作為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的前提物質(zhì)。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中除了作為氮源，玉米漿中的生長因子尤其是生物素對氨基酸的生產(chǎn)也有促進(jìn)作用，故以玉米漿作為發(fā)酵有機(jī)氮源，成本低廉并且有效[20]。從圖7來看，玉米漿的添加有利于菌體的生長，在低于20 g/L時(shí)有利于羥脯氨酸的生成，但添加量高于20 g/L時(shí)，羥脯氨酸的產(chǎn)量不但沒有提高，反而有所下降。最終優(yōu)化后，將最適的玉米漿質(zhì)量濃度定為20 g/L。

圖5 葡萄糖對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of glucose on trans-4-hydroxyproline

圖6 甘油對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of glycerol on trans-4-hydroxyproline

圖7 玉米漿對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effectofcorn steep liquor on trans-4-hydroxyproline

2.5.3 K2HPO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響對K2HPO4的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其對羥脯氨酸產(chǎn)量的影響最為顯著。從圖8來看，在K2HPO4的質(zhì)量濃度低于17 g/L時(shí)，OD600隨著K2HPO4的添加逐漸升高，當(dāng)質(zhì)量濃度高于17 g/L時(shí)，OD600有所下降。而羥脯氨酸的產(chǎn)量在質(zhì)量濃度為11 g/L時(shí)達(dá)到了最高值，由初始培養(yǎng)基的216 mg/L達(dá)到了753 mg/L。分析原因：K2HPO4為微生物的生長與氨基酸的發(fā)酵提供磷、鉀元素；同時(shí)，K2HPO4水溶液呈微堿性，可以與酸性物質(zhì)反應(yīng)生成KH2PO4，KH2PO4則與堿性物質(zhì)反應(yīng)生成 K2HPO4，K2HPO4與KH2PO4的酸堿性均不強(qiáng)，可以將發(fā)酵體系的pH維持在較為穩(wěn)定的范圍。

圖8 K2HPO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of K2HPO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.4 （NH4）2SO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響發(fā)酵過程中，（NH4）2SO4既可以作為無機(jī)氮源，同時(shí)NH4+是一種較好的緩沖離子，在某種程度上可以調(diào)節(jié)pH。其質(zhì)量濃度對羥脯氨酸產(chǎn)量的影響如圖9所示，在（NH4）2SO4質(zhì)量濃度低于 17 g/L 時(shí)，OD600隨著 （NH4）2SO4的添加而升高，當(dāng)添加質(zhì)量濃度高于17 g/L時(shí)，OD600開始下降。而羥脯氨酸的產(chǎn)量則在（NH4）2SO4質(zhì)量濃度為13 g/L時(shí)達(dá)到了最高值。

圖9 （NH4）2SO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of（NH4）2SO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.5 FeSO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 脯氨酸羥基化生成羥脯氨酸的過程是由反式-4-羥化酶催化的，而反式-4-羥化酶屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，該酶的催化過程需要Fe2+的參與[6]。從圖10來看，OD600隨著FeSO4濃度的升高而升高，也就是說，適量的添加亞鐵離子有利于菌體的生長。當(dāng)不添加FeSO4時(shí)，仍有較高的羥脯氨酸產(chǎn)量，可能是由于玉米漿中含有一定濃度的鐵元素。最終優(yōu)化結(jié)果表明，羥脯氨酸的產(chǎn)量在FeSO4濃度為1 mmol/L時(shí)達(dá)到了最高值。

圖10 FeSO4對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of FeSO4on trans-4-hydroxyproline

3.5.6 pH對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH會直接影響菌株的生長與代謝活動[21]，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，培養(yǎng)基成分的改變和微生物的代謝產(chǎn)物都會使pH發(fā)生極大變化。從圖11來看，隨著初始pH的增大，菌體OD600有所升高，但當(dāng)pH到9.5時(shí)，菌體的生長受到極大的抑制，幾乎不能夠進(jìn)行生長。而羥脯氨酸的積累量隨著pH的增大而逐漸升高，在pH為8.5時(shí)達(dá)到了最大值，之后迅速下降。表明，過堿的環(huán)境會嚴(yán)重抑制菌的生長與羥脯氨酸的產(chǎn)生。

圖11 pH對反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of pH on trans-4-hydroxyproline

3.5.7 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素優(yōu)化的結(jié)果，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交因素和水平以及正交結(jié)果分別如表2和表3所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors level of orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表中的極差得到因素的主次順序依次為：（NH4）2SO4（E）＞玉米漿（C）＞Fe2+（G）＞葡萄糖（A）＞甘油（B）＞K2HPO4（D）＞NaCl（F），得到的最佳組合：A2B3C1D2E1F1G2，即葡萄糖 4 g/L，甘油 10 g/L，玉米漿16 g/L，K2HPO411 g/L，（NH4）2SO4 8 g/L，NaCl 0.75 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.005 g/L，F(xiàn)eSO41 mmol/L。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證：同樣培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基優(yōu)化前的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.28 g/L，培養(yǎng)基優(yōu)化后的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為1.08 g/L，是優(yōu)化前的3.87倍。

3 結(jié) 語

本文在 E.coli BL21（DE3）ΔputA 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除了基因sucA并在基因組上引入羥化酶基因（hyp）。但由于基因組上的表達(dá)量不夠高，故導(dǎo)入輔助質(zhì)粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb，其中，vgb基因能夠提高細(xì)胞的溶氧，對于長時(shí)間的發(fā)酵過程較為有利。實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行菌株 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）的培養(yǎng)基優(yōu)化，在初始脯氨酸400 mmol/L，發(fā)酵24 h后的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.97 g/L。而構(gòu)建的突變菌優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后，在初始L-脯氨酸為100 mmol/L，發(fā)酵12 h時(shí)的產(chǎn)量為1.08 g/L，相比較而言，雙敲除菌 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）具有明顯優(yōu)勢，不僅縮短了發(fā)酵時(shí)間，而且提高了脯氨酸的轉(zhuǎn)化率。

接下來需在搖瓶優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，通過流加葡萄糖，維持重組大腸桿菌的持續(xù)生長從而不斷積累反式-4-羥脯氨酸，為工業(yè)化生產(chǎn)做準(zhǔn)備。