山東省黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病病原菌鑒定與抗病品種篩選

熊凱琳 劉文寶 張衛(wèi)華 方守國(guó) 馮傳榮

摘要：本試驗(yàn)以黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病病原菌為研究對(duì)象，對(duì)黃瓜田間發(fā)病情況進(jìn)行觀測(cè)，分離病原菌并對(duì)其形態(tài)、致病性及生理生化特性進(jìn)行分析測(cè)定和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)利用該菌對(duì)36份黃瓜資源進(jìn)行抗病篩選。結(jié)果表明：研究地塊黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病發(fā)病率為5.62%～43.76%，平均為24.69%。病田中分離得到的黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病病原菌經(jīng)鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。36份黃瓜資源中篩選得到2份高感資源，24份感病資源，10份中抗病資源。

關(guān)鍵詞：黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病；熒光假單胞菌；抗病資源

中圖分類號(hào)：S436.421.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0133-05

Abstract In this experiment， with the pathogen of cucumber bacterial stem soft rot as study object， the morbidity situation of cucumber in the field was observed. The morphological， pathogenicity， physiological and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria were analyzed and molecular biology identification was conducted. Then the bacteria was used to screen the resistant varieties from 36 cucumber resources. The results showed that the incidence of cucumber bacterial stem soft rot was 5.62%～43.76%， with an average of 24.69%. The pathogen of cucumber bacterial stem soft rot isolated from the disease field was identified as Pseudomonas fluorescens. There were 2 high-susceptive cultivars， 24 middle-susceptive cultivars and 10 resistant cultivars in 36 cucumber resources.

Keywords Cucumber bacterial stem soft rot； Pseudomonas fluorescens； Resistant resources

黃瓜為葫蘆科黃瓜屬一年生草本植物，富含維生素、蛋白質(zhì)、尼克酸、鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分，具有清熱止渴、利水消腫的作用[1]，是我國(guó)一種日常食用的蔬菜。

黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病是黃瓜上常見且嚴(yán)重發(fā)生的病害之一，主要為害葉片、葉柄，還可侵染莖蔓和果實(shí)，因受害部位會(huì)流出膠狀物，又叫“黃瓜流膠病”。該病近幾年在山東省、山西省、河北省、河南省、遼寧省等黃瓜主產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生[2]，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。葉片感病多從葉緣開始發(fā)病，形成褪綠病斑并伴有黃色暈圈，后隨病情發(fā)展病斑變?yōu)辄S褐色。莖干發(fā)病初期，發(fā)病部位呈水浸狀，有流膠現(xiàn)象，濕度大時(shí)可見大量白色菌膿溢出。成株期果實(shí)發(fā)病時(shí)，果實(shí)表面正常，縱向剖開果實(shí)，其內(nèi)部組織已變褐腐爛或呈開裂狀，嚴(yán)重時(shí)表面出現(xiàn)白色膿狀物[3-5]。李煥玲[6]經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，表明引起黃瓜莖軟腐病病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense），但未進(jìn)行抗病資源篩選。本研究對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病田間發(fā)病情況進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)引起山東省黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的病原進(jìn)行鑒定，并對(duì)36份黃瓜資源進(jìn)行抗病性篩選，以期為培育優(yōu)良的抗黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病品種提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜細(xì)菌性莖腐病病原菌于2016年11月取自濟(jì)南市育苗場(chǎng)典型的黃瓜發(fā)病植株，常規(guī)方法保存。

待測(cè)黃瓜資源36份，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室提供。均于2017年10月23日播種，每份材料種植25株，常規(guī)田間管理。

1.2 田間調(diào)查發(fā)病情況

2016年7月至2017年10月在濟(jì)南市育苗場(chǎng)調(diào)查黃瓜莖軟腐病地上部和根部的危害癥狀。采取5點(diǎn)取樣法調(diào)查田間發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)。

1.3 室內(nèi)病原菌分離及相關(guān)鑒定

1.3.1 分離與純化 利用LB培養(yǎng)基對(duì)采集的病葉進(jìn)行病原菌分離。具體方法為：用滅菌解剖刀切取葉片病健交界處，用70%乙醇浸泡10～30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次[7]，將消毒后的葉片放入無(wú)菌水中用鑷子碾碎，離心30 s，用移液槍吸取上清液涂抹在LB培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)12 h備用。

1.3.2 生理生化測(cè)定 待檢測(cè)菌株均在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，參考方中達(dá)[7]、蔡妙英等[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 挑取純化好的待測(cè)菌株到LB液體培養(yǎng)基中，在28℃ 200 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h 使?jié)舛冗_(dá)到3×108 cfu/mL，將菌懸液于6 000 r/min離心2 min，棄上清，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行DNA提取，以（F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCA3′； R：5′ACGGTTACCTTGTTACGACTT3′）為引物PCR擴(kuò)增16S rDNA。反應(yīng)體系20 μL：10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq Mix 10 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃反應(yīng)5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸105 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，測(cè)序。將所得序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.4 致病性鑒定 按照柯赫氏法則接種測(cè)定其致病性。具體方法為：將分離純化后的病原菌轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中以28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，利用噴霧法對(duì)黃瓜苗（資源編號(hào)GQ14-259、GQ14-247、GQ14-239）進(jìn)行接種，共接種25株，無(wú)菌水作對(duì)照，置于大棚中培養(yǎng)，定期保濕，接種后每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 36份黃瓜資源對(duì)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的抗性鑒定

試驗(yàn)于2017年7月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所基地日光溫室內(nèi)進(jìn)行，供試資源的種子均在55～60℃的溫水中浸泡30 min，后放置在28℃恒溫箱中黑暗催芽12 h，出芽后播入穴盤中，穴盤中栽培基質(zhì)為泥炭、珍珠巖、蛭石以及少量有機(jī)肥。在黃瓜苗長(zhǎng)出第一片真葉時(shí)開始噴霧接種菌液，每菌株接種30株黃瓜幼苗。常規(guī)管理，溫室內(nèi)溫度控制在28℃左右，濕度70%～90%。接種后每天進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，計(jì)算發(fā)病率和嚴(yán)重度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病情況

田間觀察發(fā)現(xiàn)，葉片感病時(shí)病斑褪綠變黃，進(jìn)一步擴(kuò)展并逐漸發(fā)展成為近圓形或不規(guī)則病斑，病斑淡黃色，有黃色暈圈。莖、葉柄、卷須被感染時(shí)初呈水浸狀，濕度大時(shí)可見菌膿溢出后逐漸沿莖縱向擴(kuò)展，莖部變軟腐爛。瓜條受害時(shí)侵染點(diǎn)出現(xiàn)水浸狀病斑，擴(kuò)展后病斑連成片不規(guī)則、呈黃褐色，濕度大時(shí)有菌膿溢出，最終導(dǎo)致果實(shí)完全腐爛。莖部被感染時(shí)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受阻，植株逐漸萎蔫，最終整株枯萎死亡，發(fā)病嚴(yán)重的地塊可造成植株全部感染（圖1）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，田間發(fā)病率為5.62%～43.76%，平均為24.69%。

2.2 病原菌分離分化

對(duì)病葉中病原菌進(jìn)行分離純化后得到四種具有代表性的菌株DT1、DT2、DT3和DT4。DT1菌落黃色，圓形凸起，邊緣呈光滑的波浪狀（圖2A）； DT2菌落淡黃色，表面光滑有光澤（圖2B）；DT3菌落呈白色，圓形凸起，邊緣光滑，表面無(wú)明顯光澤（圖2C）；DT4菌落白色，圓形，生長(zhǎng)較慢，后產(chǎn)生黃色菌膿（圖2D）。

2.3 病原菌生理生化特性

由表1可知，分離的四種待測(cè)菌株均為革蘭氏陰性細(xì)菌。DT3在KB培養(yǎng)基上有熒光其余菌株沒(méi)有。四種菌株接觸酶反應(yīng)均為陽(yáng)性，吲哚反應(yīng)陰性，明膠液化反應(yīng)陽(yáng)性。DT1能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來(lái)蘇糖產(chǎn)酸。DT2能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來(lái)蘇糖產(chǎn)酸。 DT3能利用D-葡萄糖、蔗糖、D-海藻糖、蜜二糖產(chǎn)酸。DT4能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、D-棉子糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來(lái)蘇糖、山梨醇產(chǎn)酸。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

對(duì)所得4個(gè)分離物16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)DT1在Genbank中與菌株Aeromonas hydrophila strain SS2（MF445123.1）、Aeromonas sp. FZK4M（KU193769.1）和Aeromonas media strain W-4（KM117162.1）的同源性均達(dá)到100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化測(cè)定結(jié)果，將DT1鑒定為氣單胞菌（Aeromonas）。DT2與菌株Aeromonas hydrophila strain TM1（KY786287.1）和Aeromonas hydrophila strain YC-RL3（KR819398.1）的相似性達(dá)到99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化測(cè)定結(jié)果，將DT2鑒定為氣單胞菌（Aeromonas）。DT3在Genbank中與菌株P(guān)seudomonas fluorescens strain yangyueP7（KU977136.1）、Pseudomonas fluorescens strain 90F12-2（KT695840.1）和Pseudomonas fluorescens strain 90D7A（KT695838.1）相似性均達(dá)到100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化測(cè)定結(jié)果，將DT3鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。DT4與Enterobacter cloacae菌株T02和RCB426（登錄號(hào)為KM538690.1和KT260638.1）同源性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化測(cè)定結(jié)果，將DT4鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（圖3）。

2.5 病原菌致病性測(cè)定

在黃瓜子葉上分別接種DT1、DT2、DT3和DT4的細(xì)菌懸浮液，結(jié)果表明，菌株DT1、DT2、DT4接種部位出現(xiàn)潰爛并未出現(xiàn)病斑，接種無(wú)菌水的對(duì)照無(wú)明顯變化。在黃瓜苗期，DT3接種在子葉上1 d后，黃瓜葉片未感病。接種第3 d時(shí)，子葉接種部位發(fā)生潰爛，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率達(dá)10.32%（圖4）。接種第5 d時(shí)，真葉開始發(fā)病，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率達(dá)到31.60%。接種第7 d時(shí)，發(fā)病率達(dá)56.48%，莖開始變軟。接種第10 d時(shí)，黃瓜幼苗發(fā)病率高達(dá)91.40%，黃瓜苗伏倒，病情指數(shù)達(dá)100%。說(shuō)明DT3能夠?qū)е曼S瓜莖軟腐病的發(fā)生，后續(xù)從黃瓜幼苗的發(fā)病組織上也成功分離到DT3。

綜上研究結(jié)果表明，P. fluorescens是引起濟(jì)南市黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的病原菌。

2.6 不同黃瓜資源對(duì)Pseudomonas fluorescens菌株（DT3）的抗性差異

接種3 d后36份黃瓜資源均能發(fā)病，且資源間的抗性存在差異， 而對(duì)照均未發(fā)病。由表2可知，GQ14-237、GQ14-243、GQ14-244、GQ14-245、GQ14-254、GQ14-256、GQ14-257、GQ14-268、GQ14-260、GQ14-265為中抗資源，葉片上病斑占50%左右。GQ14-168、GQ14-169、GQ14-170、GQ14-175、GQ14-234、GQ14-239、GQ14-240、GQ14-241、GQ14-242、GQ14-246、GQ14-247、GQ14-248、GQ14-259、GQ14-262、GQ14-263、GQ14-264、GQ14-266、GQ14-267、GQ14-269、GQ14-270、GQ14-273、GQ14-274、GQ14-275、GQ14-276為感病資源。GQ14-253、GQ14-258為高感資源，病斑明顯，并布滿整片葉。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)中病原菌材料取自濟(jì)南市育苗場(chǎng)的發(fā)病植株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、致病性鑒定、分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明黃瓜莖軟腐病病原菌為P. fluorescens，與李煥玲[6]報(bào)道的黃瓜莖軟腐病的病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense）不相符，為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

熒光假單胞菌（P. fluorescens）屬薄壁菌門假單胞菌科假單胞菌屬，在植物上主要作為生防菌使用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于熒光假單胞菌的生防作用已有許多報(bào)道。熒光假單胞菌能產(chǎn)生十幾種具有抗菌作用的抗生素，這些抗生素可抑制一些病原菌的生長(zhǎng)，例如熒光假單胞菌產(chǎn)生的藤黃綠膿菌素對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）以及終極腐霉（Pythium ultimum）有拮抗作用；Ahmadzadeh等[10-12]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌PfMDU2產(chǎn)生乙二酸，對(duì)植物病原菌產(chǎn)生的草酸具有解毒作用，能夠抗由立枯絲核菌引起的水稻疾病等。本研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌可引起黃瓜莖軟腐病，但熒光假單胞菌（P.fluorescens）作為植物致病菌的報(bào)道較少，前人研究發(fā)現(xiàn)P.fluorescens是引發(fā)黑松得松材線蟲病的關(guān)鍵致病因子之一[13]，呂祝邦利用16S rDNA鑒定到當(dāng)歸水爛病的病原菌也為熒光假單胞菌[14]。該菌不僅對(duì)植物存在致病性，對(duì)人和魚也有致病作用。熒光假單胞菌可在一些血液和血制品中繁殖，并且產(chǎn)生內(nèi)毒素，當(dāng)病人輸入被熒光假單胞菌污染的血液后，就會(huì)導(dǎo)致不可逆的休克[15]。沈曉靜等[16]證實(shí)熒光假單胞菌kc-1菌株能引起錦鯉赤皮病，致死率達(dá)100%。

P.fluorescens可引起黃瓜莖軟腐病，推測(cè)可能是由于熒光假單胞菌分泌的一種有毒物質(zhì)導(dǎo)致黃瓜發(fā)病，我們將會(huì)對(duì)其致病機(jī)理做進(jìn)一步研究。

防治黃瓜莖軟腐病最環(huán)保也是最安全的辦法是使用抗病品種，本研究通過(guò)對(duì)36份黃瓜資源進(jìn)行抗病性篩選，發(fā)現(xiàn)10份中抗資源，具有抗性的黃瓜資源較少，還需進(jìn)一步在該病的致病研究的基礎(chǔ)上篩選出更優(yōu)秀的抗病資源。

參 考 文 獻(xiàn)：

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