嗜熱革節(jié)孢第十二家族內(nèi)切葡聚糖酶的定點(diǎn)突變

劉嬌嬌 劉玉姣 王歡 劉寧 李多川

摘要：纖維素酶有廣泛的應(yīng)用前景，探究纖維素酶的性質(zhì)及其催化作用機(jī)制有重要意義。本研究對嗜熱革節(jié)孢第十二家族內(nèi)切葡聚糖酶steg1基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究突變對酶活性的影響。選擇位于酶催化活性通道上的6個氨基酸位點(diǎn)（N35、W37、Y77、W128、Y145、N168）進(jìn)行突變，得到8個突變酶（N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q）。結(jié)果顯示，與野生酶WT相比，所有突變酶的活性降低，其中突變酶Y77F、W128S、Y145A的Km值和kcat值都降低；N35Q的Km和kcat值都升高；W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值升高，kcat值降低。WT與突變酶的最適pH值為5.0，均保持不變。突變酶Y77F、N35Q的最適溫度降低到50℃，WT和其余突變酶的最適溫度為55℃。突變酶Y77F和N35Q在60℃處理10 min后分別保持49.34%和22.90%的活性，WT和其余突變酶在60℃處理10 min后都失活。本研究為探究內(nèi)切葡聚糖酶的催化作用機(jī)理以及分子改造奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)切葡聚糖酶；定點(diǎn)突變；酶活性；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號：S188+.3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0055-07

Abstract Cellulase has a wide application prospect， so it is of great significance to explore the properties of cellulase and its catalytic mechanism. Site-directed mutagenesis of the steg1 gene of endoglucanase in the 12th glycoside hydrolase family of Scytalidium thermoohilium was carried out to study the effect of mutation on the enzyme activity. Six amino acid sites （N35，W37，Y77，W128，Y145，N168） located on the catalytically active channel were selected and mutated to obtain eight mutant enzymes （N35Q， W37H， Y77F， W128S， Y145F， Y145A， Y145W， N168Q）. The results showed that the activities of all mutants decreased compared with WT； the Km and kcat value of mutant Y77F， W128S and Y145A all decreased； the Km and kcat value of N35Q both increased； the Km value of W37H， Y145F， Y145W and N168Q increased and the kcat value decreased. The optimum pH of WT and mutant enzyme was 5.0， both of which remained unchanged. The optimum temperature of mutant Y77F and N35Q decreased to 50℃， and the optimum temperature of WT and other mutants was 55℃. Mutant enzyme Y77F and N35Q remained 49.34% and 22.9% activity after being treated at 60℃ for 10 minutes respectively， while WT and the rest mutants were all inactive. The research laid foundations for exploring catalytic mechanism of endoglucanase and the molecular modification.

Keywords Endoglucanase； Site-directed mutagenesis； Enzymatic activity； Enzymatic property

纖維素酶是指能水解纖維β-1，4葡萄糖苷鍵，將纖維素降解成纖維二糖和和葡萄糖的一組酶的總稱，主要包含內(nèi)切葡聚糖酶（Endo-1，4-β-glucanase，EC3.2.4，簡稱EG）、外切葡聚糖酶（Exo-1，4-β-glucanase，EC3.2.1.91，簡稱CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，簡稱BG）。其中內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素等[1]。通過基因工程及蛋白工程手段在分子水平上對纖維素酶基因進(jìn)行合理設(shè)計(jì)改造，構(gòu)建能夠產(chǎn)生高活性、高熱穩(wěn)定性纖維素酶的基因工程菌，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[2-5]。

利用定點(diǎn)突變技術(shù)改善纖維素酶活性越來越受到人們的關(guān)注[6-8]。基于不同物種來源的碳水化合物活性酶類結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，將序列相似度高于30%的歸為同一GH（glycoside hydrolases，糖苷水解酶）家族，其中GH12廣泛分布于古菌、細(xì)菌、真菌三類生物中。GH12催化機(jī)制是通過糖基化酶中間物的雙取代反應(yīng)，它的催化過程是由兩對親核殘基和酸堿殘基的谷氨酸推動進(jìn)行，二級結(jié)構(gòu)由15條β鏈構(gòu)成兩個β面疊加在一起，形成一個緊湊彎曲的β-三明治結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)凹面是纖維素與酶的催化結(jié)合部位，是由18種氨基酸（F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、77Y、W128）組成一個凹槽結(jié)構(gòu)的活性通道[9]。關(guān)于GH12的研究進(jìn)展，Sandgren等[10]用定點(diǎn)突變得到熱穩(wěn)定性提高的突變株；Huang等[11]通過對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，再利用定點(diǎn)突變得到活性提高的突變株；Damásio等[12]對酶催化活性環(huán)上的保守位點(diǎn)進(jìn)行刪除和插入，證明了在水解底物時這些位點(diǎn)氨基酸功能的重要性；2016年，Calzado等[13]利用突變技術(shù)研究了酶對底物識別及特異性的分子基礎(chǔ)。

嗜熱革節(jié)孢（Scytalidium thermophilium）是一種嗜熱真菌，能產(chǎn)生熱穩(wěn)定酶。本研究克隆了嗜熱革節(jié)孢GH12家族內(nèi)切葡聚糖酶基因steg1，通過合理選擇位于第十二家族內(nèi)切葡聚糖酶STEG1活性通道上的6個氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到8個突變酶（N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q），并分析突變酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性、動力學(xué)性質(zhì)的變化，為GH12進(jìn)一步的分子改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 嗜熱革節(jié)孢（S. thermophilium）菌株，大腸桿菌（Escherichia coli）菌株，克隆載體Trans-T1，質(zhì)粒pPIC9K，畢赤酵母Pichia pastoris GS115，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Carboxymethylcellulose sodium salt購自SIGMA公司；RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒線性化試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自TaKaRa公司；必克隆試劑盒購自南京愛必夢生物材料有限公司；點(diǎn)突變試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker、Thermo scientific PagRuler Prestainde Protein Ladder購自北京全式金生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 steg1基因的克隆 接種嗜熱革節(jié)孢于羧甲基纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，50℃恒溫箱培養(yǎng)3 d后取菌絲提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。利用steg1基因序列（GenBank：AF435071.2）為模板，按照必克隆試劑盒的引物設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)引物：

F：5′-GCTTACGTAGAATTCGCTTCGATCCCGACCATCCC-3′；R：5′-TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCCACAGGTCAGCCCTG- 3′。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。目的片段大小約700 bp，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行膠回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用EcoRⅠ和NotⅠ對質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行雙酶切，將雙酶切后的pPIC9K和steg1目的基因片段進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將鑒定為陽性的重組質(zhì)?？寺∵M(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 突變質(zhì)粒的構(gòu)建 參照突變試劑盒引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)突變引物，如表1所示。

PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 3.5 min，共25個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用DMT酶處理，之后轉(zhuǎn)化DMT感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定 將重組質(zhì)粒用PmeⅠ進(jìn)行線性化酶切，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母。轉(zhuǎn)化后涂布于MD平板上，長出單菌落后進(jìn)行G418篩選，獲得多拷貝數(shù)菌株，用3′AOX1、5′AOX1通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行測序鑒定。

1.2.5 重組酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化 將陽性轉(zhuǎn)化子的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)1 d；離心收集菌體并轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每12 h補(bǔ)充甲醇至終濃度1%。離心培養(yǎng)液，在分離的上清液中加入硫酸銨至90%飽和，4℃靜置過夜，離心，沉淀透析并用HisTrap HP柱進(jìn)行蛋白純化，然后對蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)測定

（1）酶活力測定：用DNS法測定內(nèi)切葡聚糖酶的活性[14]。反應(yīng)體系：40 μL蛋白（0.2 mg/mL）、160 μL 的底物CMC-Na（0.8%、pH=5.0）。50℃水浴鍋中孵育20 min，之后加入200 μL DNS，沸水浴中煮沸10 min，冷卻至室溫。在540 nm波長下測定光吸收值。蛋白濃度的測定用BCA法[15]。

（2） 動力學(xué)參數(shù)測定：測定不同底物濃度（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）下的酶活力，反應(yīng)體系同上。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算得到Km、kcat、kcat/Km。

（3）最適溫度：測定不同溫度（40、50、55、60、65、70、80℃）條件下的酶活力，反應(yīng)體系同上。在540 nm波長下測定光吸收值。

（4）最適pH：測定不同pH值（pH=3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）條件下的酶活力。反應(yīng)體系：100 μL不同 pH值的Buffer緩沖液、40 μL蛋白（0.2 mg/mL）和60 μL的 0.8%水溶CMC-Na，反應(yīng)條件同上。在540 nm波長下測定光吸收值

（5）熱穩(wěn)定性：測定不同溫度條件下酶活力的穩(wěn)定性。將40 μL蛋白在不同溫度條件（40、50、60、70、80℃）下溫浴10 min，取出于0℃條件下放置5 min，之后加入160 μL底物CMC-Na（0.8%、pH=5.0），反應(yīng)條件同上。在540 nm波長下測定光吸收值。

（6）三維結(jié)構(gòu)模型及分析：將steg1的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務(wù)器進(jìn)行三維建模，用PYMOL軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 steg1基因的克隆

經(jīng)總RNA提取、PCR擴(kuò)增，得到約700 bp的steg1基因（圖1），序列測定結(jié)果表明，STEG1成熟蛋白編碼序列由711個核苷酸組成，經(jīng)擴(kuò)增得到的WT基因序列與GenBank注冊序列同源性為99%（第232位氨基酸由Tyr變?yōu)镻he）。

2.2 野生酶及突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)純化及SDS-PAGE分析

將WT和8個突變體的工程菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)，將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。由圖2看出，得到的是單一清晰條帶，說明純化后蛋白純度較好，蛋白分子量約為27 kD，與理論大小一致。

2.3 酶性質(zhì)的測定及分析

2.3.1 酶的比活力及動力學(xué)常數(shù)分析 以不同濃度的CMC-Na為底物測定野生酶和突變酶的酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法得到Km、kcat和kcat/Km（表2）。各突變酶N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的比活力分別為野生酶的59.68%、23.72%、58.22%、61.95%、66.45%、70.52%、62.01%、50.57%。與WT相比，突變酶的活性均有所降低。Km近似表示酶和底物親和力的大小，Km越小，表示酶與底物的結(jié)合能力越強(qiáng)。kcat表示酶的催化效率，kcat越大，酶的催化效率越高，即產(chǎn)物的釋放效率越高。與WT相比，突變酶Y77F、W128S、Y145A的Km值均降低，說明突變酶與底物的結(jié)合能力增強(qiáng)，kcat值都變小，推測反應(yīng)后產(chǎn)物的釋放效率降低；突變酶N35Q的Km增大，說明酶與底物的結(jié)合能力變?nèi)?，kcat增大，推測底物的釋放能力增強(qiáng)；而W37H、Y145F、Y145W、N168Q的Km值增大，kcat值減少，酶的活性明顯降低。

2.3.2 酶促反應(yīng)的最適pH值 不同pH條件下，將蛋白與0.8%的底物CMC-Na在50℃條件下水浴反應(yīng)，以酶活最高者為100%，計(jì)算其余條件下的相對酶活。結(jié)果（圖3）顯示，突變酶與野生酶的最適pH值一致，均為5.0。

2.3.3 酶促反應(yīng)的最適溫度 在不同溫度條件下，將蛋白與pH=5.0、0.8%的CMC-Na水浴反應(yīng)。結(jié)果（圖4）顯示，突變酶N35Q、Y77F最適溫度降為50℃，野生酶與突變酶的最適溫度都為55℃。

2.3.4 酶促反應(yīng)的熱穩(wěn)定性 將蛋白在不同溫度條件下保溫10 min，測定剩余酶活，以最高酶活者為100%，計(jì)算相對酶活力。結(jié)果（圖5）顯示，突變酶N35Q、Y77F的熱穩(wěn)定性提高，在60℃保溫10 min后分別保持22.90%、49.34%的活性，WT和其余突變酶全部失活。

2.4 三維模型對比分析

將WT氨基酸序列提交SWISS-MODEL得到WT的三維模型，該三維模型是基于灰腐質(zhì)酶GH12內(nèi)切葡聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：1uu5）建立的，相似度為99.11%。再分別建立突變酶N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的三維結(jié)構(gòu)模型。從圖6看出，本研究選擇的所有突變位點(diǎn)都位于活性通道的凹槽上。

3 討論與結(jié)論

本研究意在尋找影響嗜熱革節(jié)孢第十二家族內(nèi)切葡聚糖酶活性的相關(guān)位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變改變活性通道凹槽內(nèi)可能位點(diǎn)氨基酸種類，根據(jù)突變酶活性分析酶的催化作用機(jī)理。

結(jié)構(gòu)方面分析，經(jīng)SWISS-MODEL同源建模，與野生酶WT蛋白晶體結(jié)構(gòu)相似性極高的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：1uu5）與纖維四糖反應(yīng)過程中，Asn22與WT的Asn35重合，Trp24與WT的Trp37重合，Trp115和WT的Trp128重合，Tyr132和WT的Tyr145重合，Asn155和WT的Asn168重合，在與纖維四糖的反應(yīng)過程中這些部位氨基酸和葡糖基之間更易形成氫鍵，從而可以更容易與底物結(jié)合反應(yīng)，而且在反應(yīng)過程中，Tyr132的-COOH及主鏈上的N與葡糖基的-OH之間形成的氫鍵距離很近，更容易結(jié)合反應(yīng)[9]。Y145F酶學(xué)性質(zhì)的變化可能是由于-OH的減少，Y77F酶學(xué)性質(zhì)的變化可能是由于芳香環(huán)上-OH的減少、突變前后氨基酸由極性變?yōu)榉菢O性。在纖維素的分解過程中，纖維素酶主要依靠氫鍵和疏水作用與纖維素結(jié)合[16]。與WT相比，突變酶N35Q、N168Q的酶學(xué)性質(zhì)的變化可能是由于突變氨基酸側(cè)鏈增加了-CH2，氨基酸側(cè)鏈的變長可能改變了活性通道的擁擠程度，從而對催化活性產(chǎn)生影響。W37H、W128S、Y145A酶學(xué)性質(zhì)的變化可能是由于芳香環(huán)的缺失。芳香族氨基酸能參與形成疏水堆積表面，促進(jìn)纖維長鏈進(jìn)入催化中心[17]。Y145W酶學(xué)性質(zhì)變化可能是吲哚基的增加。一些研究表明，蛋白酶熱穩(wěn)定性的變化是更多數(shù)量的短螺旋和鹽橋使催化活性中心帶正電荷，從而使三維結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[18]，本研究中突變酶N35Q、Y77F的熱穩(wěn)定性提高。Srikrishnan等[19]在2011年基于結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和進(jìn)化方面進(jìn)行了由Tyr到Phe的定點(diǎn)突變研究，結(jié)果將酶的活性提高了4倍，本研究中突變酶Y145F、Y77F的活性沒有提高。Huang等[11]在2016年對第十二家族來自棘孢曲霉的內(nèi)切葡聚糖酶基于進(jìn)化和結(jié)構(gòu)選擇了Yyr到Trp的突變，研究結(jié)果顯示突變酶活性是WT的104.62%，本研究中突變酶Y145W活性僅為WT的62.01%，沒有達(dá)到提高的效果。

本研究克隆了嗜熱革節(jié)孢GH12家族內(nèi)切葡聚糖酶基因steg1，通過定點(diǎn)突變技術(shù)得到8種突變酶，獲得了N35Q和Y77F兩種熱穩(wěn)定性提高的突變酶，Y77F、W128S、Y145A三種Km值降低的突變酶，N35Q一種kcat值升高的突變酶。本研究為探究第十二家族內(nèi)切葡聚糖酶催化作用機(jī)理提供參考，同時為尋找影響該酶活性及其他特性的位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

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