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    噬菌體vB_SalS_DZ的生物學(xué)特性及對(duì)雞沙門氏菌病的療效

    2018-10-22 07:01:10宋新慧商延張慶宋勝敏柳林由佳朱應(yīng)民齊靜李璐璐胡明駱延波張印戴美學(xué)劉玉慶
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年7期
    關(guān)鍵詞:生物學(xué)特性噬菌體沙門氏菌

    宋新慧 商延 張慶 宋勝敏 柳林 由佳 朱應(yīng)民 齊靜 李璐璐 胡明 駱延波 張印 戴美學(xué) 劉玉慶

    摘要:抗藥性沙門氏菌的出現(xiàn),嚴(yán)重影響了抗生素對(duì)沙門氏菌病的治療效果,而噬菌體治療是一種可能的替代方法。本試驗(yàn)研究了沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ的基本生物學(xué)特性及其對(duì)沙門氏菌SM86的治療效果。噬菌體vB_SalS_DZ的生物學(xué)特性分析顯示其效價(jià)可達(dá)109 pfu/mL,透射電鏡結(jié)果顯示該噬菌體屬于有尾目T4噬菌體。對(duì)pH值的適應(yīng)范圍寬,在pH值4~12內(nèi)能保持較高的裂解活性;該噬菌體的最適pH值在5.0左右。最佳感染復(fù)數(shù)為10-6,感染宿主菌的潛伏期和爆發(fā)期均為60 min;基因組中不攜帶抗性基因和毒力基因。噬菌體vB_SalS_DZ可以使感染沙門氏菌病的SPF雞死亡率降低50個(gè)百分點(diǎn),這表明該噬菌體在治療特定的沙門氏菌感染中具有較大的應(yīng)用潛能。

    關(guān)鍵詞:沙門氏菌;噬菌體;生物學(xué)特性;噬菌體治療

    中圖分類號(hào):S852.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2018)07-0042-06

    Abstract The emergence of drug-resistant Salmonella seriously affected the therapeutic effect of antibiotics on salmonellosis, and bacteriophage therapy was a possible alternative. This study explored the basic biological characteristics of Salmonella phage vB_SalS_DZ and its therapeutic effect on Salmonella SM86. The biological characteristics of Salmonella phage vB_SalS_DZ showed that the titer was 109 pfu/mL. The results of transmission electron microscopy showed that the phage belonged to the T4 phage. It had a wide adaptation range to pH, and maintained high cleavage activity at pH 4~12. The optimum pH of the phage was about 5.0. Its optimal multiplicity of infection was 10-6, and the incubation period and outburst period were both about 60 min. The genome did not carry resistance genes and virulence genes. Animal experiments showed that phage vB_SalS_DZ could reduce the mortality of SPF chicken infected with salmonellosis by 50 percent points, which indicated that the phage vB_SalS_DZ had great potential in the treatment of specific Salmonella infection.

    Keywords Salmonella; Phage; Biological characteristics; Phage therapy

    沙門氏菌病是具有重要公共衛(wèi)生影響的人畜共患病之一,是禽場(chǎng)面臨的一個(gè)主要問題[1]??股匾恢币詠肀蛔鳛橹委熂?xì)菌感染的首選,但隨著抗生素的不合理使用,抗藥性沙門氏菌已嚴(yán)重影響抗生素的治療效果[2]。同時(shí),抗生素種類有限且新型抗生素研發(fā)困難使得噬菌體作為抗生素的替代品重新受到關(guān)注[3-5]。

    噬菌體在自然界中廣泛存在,是專門裂解細(xì)菌的一種病毒,其生命周期與細(xì)菌嚴(yán)格相關(guān)。Twort[6]在1915年發(fā)現(xiàn)了噬菌體可以抑制細(xì)菌生長,但在1917年DHerelle[7]第一次分離和鑒定出噬菌體。與抗生素相比,噬菌體特異性好,表現(xiàn)為僅感染一種細(xì)菌、血清型或毒株,這種作用機(jī)制不會(huì)導(dǎo)致共生腸道菌群的破壞。在治療期間噬菌體可以自我復(fù)制,因此可以使用低劑量的噬菌體達(dá)到治療效果。另外,噬菌體不能與真核細(xì)胞結(jié)合并在其中復(fù)制,對(duì)真核細(xì)胞沒有毒性[8]。目前已有研究分離到了可以有效減少動(dòng)物腸道沙門氏菌數(shù)目的噬菌體,但是明顯降低死亡率的噬菌體報(bào)道較少。同時(shí),因?yàn)槭删w的高度特異性,需要針對(duì)不同地方的流行菌株進(jìn)行研究,以達(dá)到最佳的應(yīng)用效果[9,10]。

    本研究從山東省分離出沙門氏菌流行菌株,針對(duì)性篩選沙門氏菌噬菌體并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)試驗(yàn)和基因組測(cè)序分析,并使用SPF雞進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn),檢測(cè)了噬菌體vB_SalS_DZ對(duì)雞沙門氏菌病的治療效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 培養(yǎng)基和試劑 SM緩沖液(Tris 6.057 g,加濃鹽酸調(diào)至pH=7.5,加入5.8 g NaCl和2 g MgSO4·7H2O,定容至1 000 mL)、LB半固體培養(yǎng)基(0.6% 瓊脂)、Dnase I和Rnase A、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、平衡酚溶液、酚-氯仿-異戊醇、無水乙醇、PEG 8000等;0.22 μm濾膜濾器。

    1.1.2 菌株和供試動(dòng)物 沙門氏菌流行菌株SM86,由山東省獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)(Varms)提供;沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ;健康的3日齡SPF雞50只,購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞場(chǎng)。

    1.2 噬菌體vB_SalS_DZ的基本生物學(xué)特性分析

    1.2.1 雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)(滴度) 參照文獻(xiàn)[11]中的方法富集噬菌體vB_SalS_DZ,利用雙層平板法測(cè)定效價(jià)。

    1.2.2 噬菌體vB_SalS_DZ的電鏡形態(tài) 參照文獻(xiàn)[12]中的方法,純化得到噬菌體顆粒后進(jìn)行透射電鏡觀察。

    1.2.3 噬菌體最適生長溫度測(cè)定 噬菌體原液使用LB液體培養(yǎng)基10倍梯度稀釋,取100 μL稀釋后的液體,與100 μL菌液混合,倒雙層平板,分別置于20、30、37、40℃和50℃下培養(yǎng)4~6 h,觀察結(jié)果,噬菌斑計(jì)數(shù)得到效價(jià),每個(gè)溫度3個(gè)平行。

    1.2.4 噬菌體pH值穩(wěn)定性測(cè)定 事先制備pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的液體LB培養(yǎng)基,各取100 μL與等體積的噬菌體原液混勻,置于37℃作用2 h后取出,10倍稀釋后做雙層平板測(cè)定效價(jià),每個(gè)pH值3個(gè)平行。

    1.2.5 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定 取新鮮菌液,離心后用新鮮的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌,利用分光光度計(jì)將菌液濃度調(diào)至1.0×108 cfu/mL(為較為準(zhǔn)確地定量該數(shù)值,可以通過預(yù)試驗(yàn)設(shè)置不同濃度的菌液進(jìn)行同一倍數(shù)的稀釋后測(cè)定吸光度,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,定位108 cfu/mL的菌液的吸光值)。設(shè)置MOI的比例分別為10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102,將等量的噬菌體液體與宿主菌液混勻后,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 h,10 000 r/min離心1 min得到噬菌體原液,10倍稀釋后雙層平板測(cè)定各個(gè)MOI的效價(jià),感染復(fù)數(shù)最高者即為該噬菌體的最佳MOI。每組3次重復(fù)。

    1.2.6 噬菌體一步生長曲線測(cè)定 按照最佳感染復(fù)數(shù)的比例將噬菌體與宿主菌等體積(500 μL)混合,37℃作用15 min,10 000 r/min離心1 min,棄上清。沉淀用LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次,使未吸附到宿主菌上的游離噬菌體完全洗脫。上述重懸液迅速加入到10 mL已于37℃預(yù)熱的新鮮LB液體中,37℃振蕩培養(yǎng)。每過20 min取樣一次測(cè)定效價(jià),以時(shí)間為橫坐標(biāo)、效價(jià)為縱坐標(biāo)繪制一步生長曲線。3個(gè)重復(fù)。

    1.3 噬菌體基因組測(cè)序分析

    使用蛋白酶K/SDS法提取噬菌體基因組DNA,利用Illumina的Hiseq平臺(tái)測(cè)序(上海美吉生物技術(shù)公司),組裝得到噬菌體基因組后進(jìn)行分析。

    采用RAST網(wǎng)站對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行注釋。登錄該網(wǎng)站后,上傳基因組文件,設(shè)定具體物種分類后提交,注釋結(jié)束后下載注釋結(jié)果。利用Geneious軟件將上述注釋結(jié)果添加到基因組上,進(jìn)行可視化分析。

    1.4 噬菌體vB_SalS_DZ治療沙門氏菌SM86的效果試驗(yàn)

    注射攻毒,沙門氏菌SM86濃度為109 cfu/mL,噬菌體vB_SalS_DZ效價(jià)為109 pfu/mL,按以下分組進(jìn)行試驗(yàn),觀察治療效果。

    A:空白對(duì)照組:200 μL 生理鹽水,SPF雞10只;

    B:噬菌體對(duì)照組:100 μL vB_SalS_DZ +100 μL 生理鹽水,SPF雞10只;

    C:細(xì)菌對(duì)照組:100 μL SM86+100 μL 生理鹽水,SPF雞10只;

    D:噬菌體治療組1:100 μL vB_SalS_DZ +100 μL SM86,SPF雞10只;

    E:噬菌體治療組2:200 μL vB_SalS_DZ +100 μL SM86,SPF雞10只。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 噬菌體vB_SalS_DZ的形態(tài)學(xué)觀察

    噬菌體vB_SalS_DZ的噬菌斑為直徑2 mm左右的透明斑(圖1A),為典型的裂解性噬菌體的噬菌斑形態(tài)。電鏡觀察結(jié)果表明,噬菌體形態(tài)基本為正二十面體頭部與細(xì)長尾部結(jié)構(gòu),其中頭部直徑50 nm左右,尾部長度在140 nm左右,尾部末端有細(xì)且短的尾絲存在。

    2.2 噬菌體vB_SalS_DZ的生物學(xué)特性測(cè)定

    噬菌體vB_SalS_DZ于宿主菌LB培養(yǎng)液中過夜振蕩培養(yǎng)后,經(jīng)測(cè)定效價(jià)為109 pfu/mL。

    噬菌體vB_SalS_DZ的最適生長溫度在37℃左右(圖2A),這也是沙門氏菌的最適生長溫度,說明噬菌體只有寄生于活細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行復(fù)制增殖;噬菌體vB_SalS_DZ在pH值高于3時(shí)都較為穩(wěn)定(圖2B),在高pH值(>9)時(shí)效價(jià)略有降低,該噬菌體具有較好的pH穩(wěn)定性;噬菌體vB_SalS_DZ的最佳感染復(fù)數(shù)為10-6(圖2C),最佳感染復(fù)數(shù)較低;一步生長曲線(圖2D)表明噬菌體vB_SalS_DZ有60 min的潛伏期,裂解期也在60 min左右。

    2.3 噬菌體vB_SalS_DZ的基因組測(cè)序

    測(cè)序結(jié)果顯示,噬菌體vB_SalS_DZ的基因組大小為42.4 kb,GC含量為49.5%。基因組注釋結(jié)果如圖3所示,包含基本的結(jié)構(gòu)蛋白、DNA聚合酶以及細(xì)胞裂解酶,但是沒有抗藥基因和毒力基因。

    2.4 噬菌體vB_SalS_DZ對(duì)雞沙門氏菌病的治療效果

    如圖4所示,只注射生理鹽水的A組SPF雞全部存活,注射噬菌體和生理鹽水的B組SPF雞也全部存活,說明噬菌體是安全的。注射沙門氏菌SM86和生理鹽水的C組,只有4只SPF雞存活,而之后采用噬菌體治療的D組和E組,SPF雞的存活率分別達(dá)到90%和80%。試驗(yàn)結(jié)果表明,噬菌體治療可有效降低感染沙門氏菌病雞的死亡率。

    3 討論與結(jié)論

    沙門氏菌的噬菌體廣泛分布于雞消化道、雞場(chǎng)及周邊環(huán)境中,這些噬菌體可以在一定程度上替代抗生素,降低細(xì)菌抗藥性,提高養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益[13]。

    本試驗(yàn)分離到的沙門氏菌噬菌體vB_SalS_DZ效價(jià)可達(dá)到109 pfu/mL,由正二十面體和尾部組成,屬于T4類噬菌體,這也是噬菌體研究中最常見的一種噬菌體[12,14,15]。噬菌體vB_SalS_DZ的最佳感染復(fù)數(shù)為10-6,已報(bào)道噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)一般在0.01~0.10[16-18],本株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)低,說明可以使用低劑量的噬菌體達(dá)到較好的治療效果。感染宿主菌的潛伏期為60 min,爆發(fā)期為60 min。潛伏期和爆發(fā)期短,可以在短時(shí)間內(nèi)殺死宿主菌,有效控制沙門氏菌的生長。對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較寬,在pH值4~12間能保持較高的裂解活性。

    噬菌體基因組中攜帶抗性基因和毒力基因,在噬菌體應(yīng)用過程中可能會(huì)導(dǎo)致兩種基因的水平轉(zhuǎn)移,所以在應(yīng)用之前對(duì)其進(jìn)行基因測(cè)序就顯得尤為重要。本研究對(duì)噬菌體vB_SalS_DZ基因組的測(cè)序結(jié)果證實(shí),基因組中不存在抗性基因和毒力基因,這也說明本噬菌體對(duì)于生態(tài)環(huán)境是安全的,不會(huì)引入新的基因污染。

    噬菌體vB_SalS_DZ的生物學(xué)特性決定了本株噬菌體具有相當(dāng)好的應(yīng)用前景。首先,生產(chǎn)過程中不需要嚴(yán)苛的環(huán)境;其次由于其較低的最佳感染復(fù)數(shù),減少了噬菌體的使用劑量,降低了使用成本;另外,基因組測(cè)序結(jié)果也證實(shí)了本株噬菌體的安全性。

    噬菌體的治療效果取決于效價(jià)、應(yīng)用形式和類型以及應(yīng)用期。在家禽中長期使用噬菌體已被證明可以減少定植于消化道的沙門氏菌[19]。Fiorentin等[20]的研究也表明,單劑量口服1011 PFU的噬菌體混合物可將腸炎沙門氏菌菌株的發(fā)生率降低3.5個(gè)對(duì)數(shù)單位。噬菌體治療的積極效果也可以在蛋雞群中防治由雞沙門氏菌菌株引起的水平感染中觀察到[21]。本研究中,噬菌體vB_SalS_DZ的動(dòng)物治療試驗(yàn)表明,使用噬菌體可以有效降低感染沙門氏菌的雞的死亡率。未使用噬菌體的試驗(yàn)組,死亡率在60%,而使用100 μL和200 μL噬菌體治療的試驗(yàn)組,死亡率分別降低至10%和20%,這充分證實(shí)了噬菌體的治療效果。但是需要指出的是,200 μL噬菌體的治療效果要低于100 μL噬菌體的治療效果,這可能是由于試驗(yàn)誤差所致,另外,也說明了100 μL的劑量已經(jīng)可以達(dá)到最佳治療效果。

    本試驗(yàn)對(duì)噬菌體vB_SalS_DZ的基本性質(zhì)和治療效果進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)有較好的應(yīng)用潛力,可以有效治療雞沙門氏菌病。在抗生素抗藥性日益嚴(yán)重的背景下,噬菌體具有很大的應(yīng)用潛力,也被視為最有效的抗生素替代方法。噬菌體制劑的發(fā)展可能是未來對(duì)抗人和動(dòng)物細(xì)菌性疾病的最有效方法之一,也使獲得安全且不含抗生素的食品成為可能。

    參 考 文 獻(xiàn):

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