蛋白核小球藻超聲波破壁方法的優(yōu)化

岳敏，趙熙寧，宋亞楠，安茜，薛金愛(ài)，季春麗，崔紅利，李潤(rùn)植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

微藻是一類能光自養(yǎng)的單細(xì)胞或多細(xì)胞群體藻類，生長(zhǎng)速度快、單位面積生物質(zhì)產(chǎn)量高，特別是一些微藻能高水平合成積累油脂，可用于生產(chǎn)食用油、工業(yè)用油和生物柴油。微藻光合作用還可以吸收并有效利用大量工業(yè)廢氣中的CO2及氮化物，可用于生物減排和治理環(huán)境污染[1]。此外，微藻細(xì)胞還能合成積累多種化合物，亦可用來(lái)生產(chǎn)具有高附加值生物基產(chǎn)品，如脂肪、多糖、色素、抗氧化劑、蝦青素、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)及生物活性物質(zhì)，這些化合物已廣泛應(yīng)用于化妝品、藥物、食品、農(nóng)業(yè)以及化學(xué)工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[2]。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，光合效率高、繁殖能力強(qiáng)，分布范圍廣，分類上為綠藻門、小球藻屬[3]。蛋白核小球藻不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、葉綠素、多種維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]，且含有大量的油脂，既可用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)，還可以用于生產(chǎn)生物柴油等。尤其是蛋白核小球藻營(yíng)養(yǎng)成分全面均衡，被譽(yù)為完美的天然營(yíng)養(yǎng)食品[5]。幾年來(lái)，蛋白核小球藻規(guī)?；B(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)健康食品等產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速、市場(chǎng)需求日益增加。然而，蛋白核小球藻具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，制約著細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)、油脂、藻多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效萃取和產(chǎn)品加工[6]。未破壁的全藻細(xì)胞作為食物原料直接食用，其營(yíng)養(yǎng)成分被吸收和利用率極低。因此，建立安全、有效的藻細(xì)胞破壁工藝是蛋白核小球藻等微藻營(yíng)養(yǎng)及功能產(chǎn)品生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[7]。目前，微藻細(xì)胞破壁的方法主要分為機(jī)械法和非機(jī)械法[8]。非機(jī)械法如酸熱法、有機(jī)溶劑和生物酶法等使用大量的化學(xué)試劑或生物酶，不僅成本高、還會(huì)影響到萃取化合物的質(zhì)量，這些方法多用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模破壁，不具備規(guī)?；a(chǎn)的潛力[9]。機(jī)械法破壁如超聲波、研磨法等優(yōu)勢(shì)在于破壁較充分，適用于各種藻類，無(wú)污染且適用于大規(guī)模生產(chǎn)。與研磨法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高以及僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模相比，超聲波破壁作為一種物理方法有明顯優(yōu)勢(shì)，它是利用大于20kHZ的超聲波使細(xì)胞壁破碎，耗能較低、細(xì)胞破碎均勻、物質(zhì)萃取率較高、無(wú)污染，操作簡(jiǎn)單便捷，有望實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和規(guī)模化破壁[10]。迄今，還沒(méi)有建立應(yīng)用超聲波處理對(duì)蛋白核小球藻進(jìn)行破壁的較完善技術(shù)工藝。本文以本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的富油蛋白核小球藻藻株CP-SX05為試材，以藻細(xì)胞破碎率和油脂萃取率為評(píng)判指標(biāo)，通過(guò)對(duì)超聲波處理所涉及到的藻細(xì)胞密度(g·mL-1)、藻細(xì)胞含水量、濕藻液pH、藻液量/體積和超聲波輸出功率、處理時(shí)間以及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期建立蛋白核小球藻簡(jiǎn)易有效的超聲波破壁方法，為后續(xù)建立規(guī)模化微藻破壁及油脂等天然化合物萃取的高效低成本工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)

藻種為本實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定純化獲得的一株蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)Cp-SX05，該藻株生長(zhǎng)速度很快，且油脂和蛋白質(zhì)含量高，是可商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)良株系。

培養(yǎng)：本研究選出了最適合上述藻株生長(zhǎng)和油脂積累的BG-11培養(yǎng)基，其母液成分及工作液組分見(jiàn)表1和表2。培養(yǎng)液pH為7左右，室溫23 ℃，光照3 500 lx，通氣條件：CO2含量為3%，通氣速率為5 L·min-1，培養(yǎng)9～10 d。

表1 BG-11培養(yǎng)基(母液)配方Table 1 Medium composition of BG11

1.1.2 試劑與儀器

試劑：蒸餾水，三氯甲烷，甲醇，正己烷，石油醚，濃鹽酸，氫氧化鈉，氯化鈉，乙醚，濃硫酸。

儀器：AX523ZH/E精密電子天平，Jan-78磁力加熱攪拌器，HY-2 A調(diào)速多用振蕩器，PS-100AL超聲波儀，HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋，MLS-3 781 L-PC高壓滅菌鍋，KH-55AS電熱恒溫干燥箱，BCD-539WT冰箱，ALLEGRA X-30R離心機(jī)，ALPHA 1-4LD冷凍干燥機(jī)，STARTER2100pH計(jì)，BIC-400光照培養(yǎng)箱，JTONE-J1-3微波爐，BC-R205C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DHG-9 076 A數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent 7890B氣相色譜儀。

表2 BG-11工作液配方Table 2 Working solution formulations of BG11

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油脂含量的測(cè)定

取蛋白核小球藻50 mL，與正己烷1∶1混勻，在搖床上過(guò)夜12 h，離心收集上清液，蒸餾干燥放入烘箱烘干后稱重。油脂提取率按下式計(jì)算：

油脂提取率/%=W/(Wn×V)×100%

式中: W為提取的油脂質(zhì)量/g；Wn為每毫升藻液藻粉干重/g·mL-1；V為藻液體積/mL

1.2.2 OD值測(cè)定及藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

利用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定蛋白核小球藻的OD680值，藻細(xì)胞的個(gè)數(shù)利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 蛋白核小球藻細(xì)胞干重的測(cè)量

取對(duì)數(shù)期的蛋白核小球藻的藻液，8 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，用蒸餾水重懸洗滌3次后離心棄上清，置于冷凍干燥機(jī)中24 h以后稱重。

1.2.4 藻細(xì)胞破碎率計(jì)算

細(xì)胞破碎率=(M-Mn)/M×100%

式中：M為視野中藻細(xì)胞原始個(gè)數(shù)；Mn為經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎后視野中藻細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻生長(zhǎng)曲線

每天在同一時(shí)間取蛋白核小球藻液，在最佳波長(zhǎng)OD680進(jìn)行吸光度測(cè)定，3組平行重復(fù)，繪制生長(zhǎng)曲線。如圖1所示，蛋白核小球藻生長(zhǎng)曲線呈“S”型。培養(yǎng)前3 d，蛋白核小球藻生長(zhǎng)速度緩慢，處于生長(zhǎng)停滯(緩慢)期。在生長(zhǎng)4 d后，蛋白核小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度大幅度增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量也呈指數(shù)遞增，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。從第11天開始蛋白核小球藻進(jìn)入了靜止期，細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降。

圖1 蛋白核小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa

2.2 含水量對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響

分別取不同含水量的蛋白核小球藻100 mL，搖勻。在溫度為20 ℃，輸出功率為200 W，超聲時(shí)間為 6 min，破碎 10 s 后間歇 10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。由圖2可見(jiàn)，藻細(xì)胞破壁率隨著含水量的增加呈上升趨勢(shì)。含水量為20%～50%，破壁率均達(dá)到90%以上。含水量大于50%時(shí)，破壁率可上升到95%以上。但是，藻細(xì)胞含水量越大，藻液濃度低，處理效率和油脂提取率也降低。因此，藻細(xì)胞含水量在20%～50%之間，破壁效益最佳。

圖2 含水量對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.2 Effect of water content on the broken rate of algae cells

2.3 超聲時(shí)間對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的蛋白核小球藻100 mL，在溫度為20 ℃，輸出功率為200 W，不同的超聲時(shí)間下，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖3所示，破壁率隨著時(shí)間的增加逐漸增大，但是在前15 min，細(xì)胞破壁率隨著超聲時(shí)間增加大幅度上升，在第15 min時(shí)破壁率達(dá)到93.8%，在15 min以后增長(zhǎng)不明顯。綜合考慮成本，超聲15 min效益最佳。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the rate of rupture of algae cells

2.4 超聲功率對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，溫度為20 ℃，不同的超聲功率下，超聲時(shí)間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖4所示，隨著超聲功率的增加，細(xì)胞破壁率逐漸增加，在250 W的時(shí)候破壁率達(dá)到94.1%，250 W以后基本沒(méi)什么變化。因此，最佳超聲功率選為250 W。

圖4 超聲功率對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on Shock broken rate of algae cells

2.5 超聲處理溫度對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，不同溫度下，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖5所示，隨著溫度增加，蛋白核小球藻的破壁率也在增加，在25 ℃時(shí)，細(xì)胞破壁率達(dá)到94.3%。在溫度超過(guò)25 ℃以后，細(xì)胞破碎率增加緩慢，且過(guò)高的溫度會(huì)破壞細(xì)胞的有機(jī)化合物。因此，最佳溫度確定為25 ℃。

圖5 溫度對(duì)細(xì)胞破壁率的影響Fig.5 Effect of temperature on cell breakdown rate

2.6 濕藻液pH對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的藻液100 mL，設(shè)置不同pH，溫度為20 ℃，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為 6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖6所示，藻細(xì)胞在強(qiáng)酸性條件下，破壁率高，因?yàn)樗嵝詴?huì)使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變疏松。但是，強(qiáng)酸會(huì)使脂肪酸等有機(jī)物水解，而且不適于進(jìn)行大規(guī)模處理。所以，確定濕藻液最佳pH為5。

圖6 pH對(duì)藻細(xì)胞破壁率的影響Fig.6 Effect of pH on cell breakdown rate in algae

2.7 藻液體積對(duì)細(xì)胞破壁率的影響

取含水量為30%的不同體積的藻液，pH為5，溫度為20 ℃，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為6 min，破碎10 s 后間歇10 s。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)破壁前后視野中完整細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞破碎率，3次平行計(jì)數(shù)。如圖7所示，隨著藻液量的增加，小球藻的破壁率逐漸降低,在藻液體積為120 mL時(shí)破壁率最高達(dá)到94.8%。因此，最佳藻液量確定為120 mL。

圖7 藻液量對(duì)細(xì)胞破碎率的影響Fig.7 Effect of algae volume on cell broken rate

2.8 優(yōu)化后的超聲法對(duì)油脂提取率的影響

由上述測(cè)試結(jié)果可知，超聲波破壁的優(yōu)化參數(shù)為：藻液含水量為30%，溫度為25 ℃，藻業(yè)體積為120 mL,超聲時(shí)間為15 min，超聲功率為250 W，pH為5。如表3所示，沒(méi)有超聲破壁處理的蛋白核小球藻提取的油脂含量為20.4%，經(jīng)過(guò)研磨破壁處理后提取的油脂含量為39.8%，比未破壁增加95%。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的超聲破壁后，蛋白核小球藻提取的油脂含量為40.1%，比未破壁增加96.8%。

表3不同破壁方法對(duì)蛋白核小球藻油脂萃取的影響

Table3 Effect of different cell wall breaking methods on oil extraction inC.pyrenoidosa

未破壁Unbroken cell wall研磨破壁Grinding 超聲波破壁Ultrasonic treatment油脂含量/%20.4±0.2339.8±0.5640.1±0.24

3 討論

微藻光合固碳能力強(qiáng)，具有較高的生長(zhǎng)速度和較大的油脂積累量,可廣泛應(yīng)用于能源、醫(yī)藥、食品等行業(yè),亦是最有前景的可再生能源的優(yōu)質(zhì)生物原料[11]。微藻破壁是微藻制油工藝以及其他化合物萃取工藝中的至關(guān)重要環(huán)節(jié)[12]。已有研究探討提高細(xì)胞破壁率和減低成本的方法，但現(xiàn)階段微藻下游加工環(huán)節(jié)干燥和破壁耗能過(guò)高，制約其產(chǎn)業(yè)化[13]。孫利芹等[14]采用反復(fù)凍融法，在冷凍溫度為-30 ℃，對(duì)紫球藻細(xì)胞進(jìn)行破碎，破碎率達(dá) 70%左右?？追裁舻萚15]利用酸熱法提取酵母細(xì)胞內(nèi)的油脂，結(jié)果表明油脂最高提取率為39.87%。歐陽(yáng)琴等[16]利用超聲法和凍融法對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行破壁處理，細(xì)胞破碎率高達(dá)91.4%。

與其它已有的破壁方法相比，超聲法是一種操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染、耗液量小的物理破壁方法，且細(xì)胞破壁率較高。王雪青等[17]采用超聲破碎處理衣藻，破碎率可達(dá) 90%以上。湯衛(wèi)華等[18]利用超聲波法、反復(fù)凍融法和勻漿法對(duì)三角褐指藻進(jìn)行細(xì)胞壁破碎處理，結(jié)果破壁率最高的為超聲波破碎法，破壁率達(dá)到91.5%,油脂提取率為18.1%。

本研究以蛋白核小球藻為試材，對(duì)超聲破壁條件和參數(shù)進(jìn)行了探索與優(yōu)化。最佳條件為超聲溫度25 ℃，超聲時(shí)間為15 min，超聲功率為250 W，破碎率達(dá)到90%以上，這與孫利芹等[15]研究的超聲對(duì)紫球藻破碎效果相似，并且蛋白核小球藻破壁率比紫球藻高?？追裁舻萚16]的研究中發(fā)現(xiàn)酸會(huì)使細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變疏松，有助于細(xì)胞壁裂解。本文研究了藻液pH對(duì)蛋白核小球藻破壁率的影響，結(jié)果表明pH越高細(xì)胞破壁率越低。pH低，細(xì)胞破碎率高。但是，大量的酸會(huì)增加成本，不利于大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用。所以，本研究選擇最佳pH為5，細(xì)胞破壁率達(dá)到93.8%(圖6)。大多數(shù)的研究報(bào)道，微藻油脂提取通常利用干藻粉，然而微藻干燥過(guò)程會(huì)增加成本[19]。為了降低成本達(dá)到規(guī)模化的生產(chǎn)，本試驗(yàn)選擇濕藻體用于破壁和提油。結(jié)果表明，隨著藻細(xì)胞含水量的增大，細(xì)胞破壁率逐漸增大，在含水量達(dá)到20%～50%時(shí)，細(xì)胞破壁率變化不明顯，均能達(dá)到92%以上(圖2)。當(dāng)含水量達(dá)到50%，破壁率高達(dá)95%，含水量高于50%，破壁率雖然升高但油脂提取率明顯降低?？紤]對(duì)油脂提取率和能量消耗的影響，藻細(xì)胞含水量選擇20%～50%為最佳，易于規(guī)?；瘧?yīng)用，這為蛋白核小球藻規(guī)?；B(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及產(chǎn)品的生產(chǎn)加工提供了科學(xué)依據(jù)。利用研磨破碎法為對(duì)照，測(cè)定優(yōu)化的超聲波破壁法對(duì)蛋白核小球藻油脂萃取效果的影響，結(jié)果顯示，研磨破碎藻細(xì)胞后提取油脂得到的藻細(xì)胞含油量比沒(méi)有破壁的藻細(xì)胞油脂萃取所得含油量增加了95%。利用優(yōu)化的超聲波法對(duì)蛋白核小球藻破壁處理后提取油脂所得含油量比沒(méi)有破壁藻細(xì)胞萃取油脂所得含油量增加了96.8%。

4 結(jié)論

本文建立了簡(jiǎn)易有效的蛋白核小球藻超聲波破壁最佳條件和參數(shù)：室溫25 ℃，濕藻液pH5,藻細(xì)胞含水量20%～50%，超聲波輸出功率250 W，處理時(shí)間為15 min，和處理量每次120 mL。依此條件和參數(shù)進(jìn)行處理，蛋白核小球藻破壁率達(dá)到94.8%，油脂萃取率達(dá)40.1%。這為蛋白核小球藻優(yōu)異藻株CP-SX05規(guī)?；B(yǎng)殖聯(lián)產(chǎn)高值營(yíng)養(yǎng)及功能產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的建立提供了科學(xué)依據(jù)。