響應面法優(yōu)化乙醇提取草果黃酮的工藝研究

王婉愉，李姣，張曉峰，王霄凱，時寶慶

(鄭州大學公共衛(wèi)生學院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，鄭州 450001)

草果(AmomumtsaokoCrevostetLemarie)為姜科豆蔻屬多年生藥食兩用草本植物，廣泛分布于中國西南部與越南等地[1,2]。干燥成熟的草果果實既是生活中必備的食用香辛料，又是傳統(tǒng)的中藥材，具有健脾、溫胃止痛和止嘔截瘧等功能[3]。有研究表明，黃酮是草果中重要的活性物質(zhì)之一，其不僅可以調(diào)節(jié)血糖血脂，而且具有抗炎、抗氧化與神經(jīng)保護等功效[4,5]。黃酮類化合物也常作為藥效學指標進行定性與定量分析，是一類極具發(fā)展前景的天然抗氧化劑[6,7]。當前，關于草果黃酮的提取與加工工藝的應用也受到廣泛關注。響應面法是通過建立數(shù)學模型以最經(jīng)濟的方式對所選試驗參數(shù)進行全面分析，并且預測最優(yōu)的工藝參數(shù)[8]。因此，本研究通過響應面優(yōu)化試驗建立草果黃酮提取過程中的影響因素與黃酮提取量相關關系的數(shù)學模型，旨在得到最優(yōu)的草果黃酮醇提的工藝參數(shù)，為草果黃酮類產(chǎn)品的深加工奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草果：購于鄭州市市場。

槲皮素(分析標準品，≥98.5%)：阿拉丁試劑公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

10-2BS電熱鼓風干燥箱 天津市華北實驗儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 河南智誠科技發(fā)展有限公司；臺式高速離心機 艾本德(中國)有限公司；QL-901渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Spectra Max M2e多功能微孔板讀數(shù)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司；AL204 電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料預處理

將草果清洗干凈，于60 ℃烘干，過40目的分樣篩以得到草果干粉。用四氯甲烷浸泡12 h脫脂(料液比為1∶10)，將脫脂粉于室溫下烘干。取干燥的脫脂粉末10 g加入乙醇提取液，按試驗設計的溫度和提取時間在135 r/min振蕩頻率下進行提取，提取結束后抽濾。用旋轉蒸發(fā)儀濃縮濾液，定容到40 mL，即為提取液，濃度記為250 mg/mL。

1.3.2 黃酮含量的測定

參照Arvouet G A等的方法，采用改進的Dowd方法測定總黃酮含量[9]。以槲皮素為標準品，每1 g樣品干粉(dry weight, DW) 的黃酮含量以槲皮素當量(quercetin equivalent，QE) 表示，記為mg QE/g DW。

1.3.2.1 槲皮素標準品的配制

準確稱取干燥的槲皮素標準品2 mg，溶解于10 mL甲醇溶液中，得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的槲皮素標準溶液。

1.3.2.2 標準曲線的制備

分別吸取0.78，1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μL槲皮素標準溶液于96孔板中，加甲醇溶液至100 μL，最終各孔濃度依次為1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 mg/mL。隨后加入100 μL 2% AlCl3甲醇溶液，于25 ℃靜置10 min，于415 nm處測定其吸光度值。以槲皮素質(zhì)量濃度為橫坐標，以測定得到的吸光度值為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。所得到的標準曲線方程為：Y=0.0104X+0.0979 (Y為吸光度，X為槲皮素的質(zhì)量濃度，R2=0.999)。

圖1 槲皮素標準曲線

1.3.2.3 樣品中黃酮含量的測定

準確吸取200 μL樣品溶液，加入96孔板中，并且對其做梯度稀釋，按上述標準曲線的測定方法和步驟測定樣品吸光度。將樣品的吸光度值代入標準曲線方程中計算樣品黃酮的提取量(mg QE/g DW)。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

準確稱取草果干粉10 g，在液料比為20∶1 (mL/g)，提取時間為2 h，溫度為40 ℃，乙醇濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%的條件下浸提，抽濾得提取液，濃縮定容到40 mL，測定黃酮含量。

1.3.3.2 液料比對黃酮提取量的影響

準確稱取草果干粉10 g，在提取時間為2 h，溫度為40 ℃，乙醇濃度為40%，液料比分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g) 的條件下浸提，抽濾得提取液，濃縮定容到40 mL，測定黃酮含量。

1.3.3.3 提取時間對黃酮提取量的影響

準確稱取草果干粉10 g，在乙醇濃度為60%，液料比為20∶1 (mL/g)，溫度為40 ℃，提取時間分別為1，2，3，4，5 h的條件下浸提，抽濾得提取液，濃縮定容到40 mL，測定黃酮含量。

1.3.3.4 提取溫度對黃酮提取量的影響

準確稱取草果干粉10 g，在乙醇濃度為60%，液料比為20∶1 (mL/g)，提取時間為2 h，溫度分別為30，40，50，60，70 ℃的條件下浸提，抽濾得提取液，濃縮定容到40 mL，測定黃酮含量。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗設計

采用Design-Expert 8.02軟件中的Box-Benhnken方法設計試驗。根據(jù)單因素試驗結果，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)、提取溫度(D)4個因素，以黃酮提取量(Y)為響應值，設計4因素3水平響應面優(yōu)化試驗。響應面試驗各因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

試驗得到的數(shù)據(jù)均為多次重復試驗得到的平均值，選擇單因素試驗結果較好的水平，采用Design-Expert 8.02軟件進行分析，得到回歸模型及最優(yōu)工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

圖2 乙醇濃度對草果黃酮提取量的影響

由圖2可知，草果黃酮的提取量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在乙醇濃度為70%時達到最大，隨后提取量開始下降。分析其原因可能是草果中含有較多的黃酮苷類物質(zhì)，用極性較大的溶劑提取效果較好，隨著乙醇濃度的增大，活性物質(zhì)細胞的溶脹增強，可促進提取溶劑向細胞內(nèi)有效地滲透，從而顯著增加樣品黃酮的提取。當乙醇濃度超過70%時，其他醇溶性雜質(zhì)、色素以及脂溶性雜質(zhì)的溶出量會隨之增加，這會影響黃酮類化合物的溶出。因此，考慮到提取效果與試驗成本，選擇乙醇濃度為70%較合適。

2.1.2 液料比對黃酮提取量的影響

圖3 液料比對草果黃酮提取量的影響

由圖3可知，隨著液料比的增大，草果黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當液料比為20∶1 (mL/g)時，黃酮提取量達到最高點，繼續(xù)增加提取溶劑的量，黃酮提取量逐漸下降，并趨于平緩。分析其原因可能是由于溶質(zhì)的濃度差和溶劑能夠溶解的物質(zhì)的量在不斷增大，有利于黃酮浸出，但當液料比達到20∶1 (mL/g)時，黃酮提取基本達到飽和。當液料比繼續(xù)增大時，可能會促使雜質(zhì)的溶出，同時會增加后續(xù)提取液的濃縮時間。因此，從提取效果與節(jié)能的角度考慮，選擇液料比為20∶1 (mL/g)比較合適。

2.1.3 提物時間對黃酮提取量的影響

圖4 提取時間對草果黃酮提取量的影響

由圖4可知，草果黃酮的提取量隨提取時間的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當提取時間為4 h時，黃酮提取量達到最大，隨后開始下降。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是隨著提取時間的增加，促使草果中的黃酮化合物充足地溶出，但提取時間過長，就會損失一定量提取出的活性，相對應的雜質(zhì)溶出得也越多[10]。因此，從節(jié)約時間與提取效果的角度來說，選取提取時間為4 h較合適。

2.1.4 提取溫度對黃酮提取量的影響

圖5 提取溫度對草果黃酮提取量的影響

由圖5可知，當提取溫度小于60 ℃時，草果黃酮的提取量隨著提取溫度的升高而增加；繼續(xù)升高提取溫度，黃酮提取量逐漸下降。分析其原因可能是隨著溫度的升高，加快了溶劑分子的擴散速度，同時也促進了黃酮類化合物的溶出，但過高的提取溫度，可能會在一定程度上影響黃酮的穩(wěn)定性，加快其氧化破壞的進程[11]。因此，選擇提取溫度為60 ℃較合適。

2.2 響應面分析

2.2.1 模型擬合與統(tǒng)計分析

在單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素對黃酮提取量的影響，根據(jù)Box-Benhnken試驗設計原理，選取乙醇濃度(%)、提取時間(h)、液料比(mL/g)、提取溫度(℃)進行4因素3水平的響應面分析方法，確定草果黃酮提取的最佳工藝條件，結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

采用Design-Expert 8.02軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，以草果黃酮提取量(Y)為響應值，得到草果黃酮提取量之于各個因素的因子編碼值回歸方程為：Y=1.21+0.023A+0.015B+0.020C+0.052D-0.034AB-0.039AC-0.023AD-0.020BC+0.045BD+0.024CD-0.25A2-0.20B2-0.23C2-0.20D2。

表3 回歸模型和方差分析

續(xù) 表

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)

由表3可知，模型F值為53.62，P值小于0.0001，表示響應面回歸模型達到了高度顯著的水平，而失擬項不顯著 (P>0.05)，預測值與試驗值之間有較好的相關性，模型的確定系數(shù)R2=0.9817，校正后的R2=0.9634。說明該模型能解釋96.34%響應值的變化，因而該模型的擬合程度比較好，可以用此模型對草果乙醇和提取物黃酮提取量進行分析和預測。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項A，AC，BD對黃酮提取量的影響達到顯著水平(P<0.05)：方程一次項D和二次項A2，B2，C2，D2對黃酮提取量的影響達到極顯著水平(P<0.01)。根據(jù)F值可知，各個因素對槲皮素提取量影響的大小順序為：提取溫度(D)>乙醇濃度(A)>液料比(C)>提取時間(B)。

2.2.2 響應面分析

圖6 乙醇濃度與液料比交互作用對草果黃酮提取量影響的響應面和等高線圖

圖7 提取時間與提取溫度交互作用對草果黃酮提取量影響的響應面和等高線圖

將2個因素固定在零水平，經(jīng)Design-Expert 8.02軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，觀察其余2個因素之間的交互作用。得到2個因素間的響應面與等高線圖，響應面圖能夠反映出各個因素之間的相互作用關系，圖中曲線越陡峭說明對響應值的影響越大[12]；等高線圖可以比較直觀地反映出各因素對草果黃酮提取量的交互作用程度。等高線呈圓形表示2個因素的交互作用不顯著，呈馬鞍形或橢圓形則表示2個因素之間的交互作用較顯著[13]。由圖6可知，響應面圖的兩邊坡度都比較陡峭，說明乙醇濃度(A)與液料比(B)對黃酮提取量的影響都較大，且2個因素間的交互作用顯著，這與表3中的顯著性分析結果一致。在乙醇濃度與液料比交互作用等高線圖中，等高線沿液料比增高方向密集，降低方向稀疏，說明降低液料比會顯著影響總黃酮提取量。同理，分析圖7中響應面圖與等高線圖可知提取時間(B)與提取溫度(D)2個因素間的交互作用顯著。

2.2.3 驗證試驗

通過使用Design-Expert 8.02統(tǒng)計軟件進行響應面優(yōu)化，獲得草果總黃酮提取量的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度70.33%、液料比20.47∶1 (mL/g)、提取時間4.05 h、提取溫度61.36 ℃。根據(jù)實際操作情況以及投入成本做相應的調(diào)整，將最佳提取條件改為乙醇濃度70%、料液比20∶1 (mL/g)、提取時間4 h、提取溫度61 ℃，在該條件下的響應面模型預測值為1.217 mg QE/g DW，根據(jù)修改后的最佳工藝條件，做3次平行試驗進行驗證，測定得到的黃酮提取量的均值為 1.229 mg QE/g DW，相對誤差為0.01 %，說明該優(yōu)化模型數(shù)據(jù)可靠，具有實用價值。

3 結論

本試驗通過響應面法優(yōu)化草果黃酮的醇提工藝，該提取方法利用振蕩增加了機械振動作用，加速有效成分進入溶劑中。振蕩可能不如超聲波輔助提取率高，但可避免空化效應，從而保護黃酮中活性分子的結構不被破壞[14]。本研究以單因素的試驗結果為參照依據(jù)，采用Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，以黃酮提取量為響應值，建立草果黃酮提取的二次多項式數(shù)學模型，該模型能夠真實反映變量與響應值之間的變化關系。利用該模型對影響黃酮提取的4個主要因素以及因素之間的交互作用進行分析探討。得到的草果黃酮提取優(yōu)化回歸模型校正后的相關系數(shù)R2=0.9634，表明該模型擬合效果較好，并且此模型在試驗范圍內(nèi)能較準確地預測草果黃酮的提取量。最終得到的草果黃酮醇提工藝的最優(yōu)條件為乙醇濃度70%、液料比20∶1 (mL/g)、提取時間4 h、提取溫度61 ℃。

經(jīng)試驗驗證，草果黃酮提取量的實際值為1.229 mg QE/g DW，與模型預測值基本相符。說明經(jīng)響應面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有實際參照價值。袁園等所做的關于草果黃酮工藝優(yōu)化的最佳工藝為乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度40 ℃、超聲功率160 W、提取時間60 min[15]。對比可知，本研究在很大程度上降低了料液比，為草果黃酮的提取提供了一種新工藝，有益于草果黃酮在食品工業(yè)上的推廣與應用。