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    發(fā)酵大蒜加工過程中功能物質(zhì)與抗氧化活性的變化研究

    2018-10-22 12:01:36唐仕榮陳尚龍苗敬芝高菲孫苗
    中國調(diào)味品 2018年10期
    關(guān)鍵詞:黑蒜大蒜自由基

    唐仕榮,陳尚龍,苗敬芝,高菲,孫苗

    (1.徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院,江蘇 徐州 221018;2.徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室,江蘇 徐州 221018)

    大蒜是一種古老的藥食兩用植物,具有健脾、抗菌、提高免疫力、降血壓、抗腫瘤等作用。但常常由于其刺激性和蒜臭味導(dǎo)致無法得到消費者的廣泛認可。新鮮大蒜在高溫高濕條件下自然發(fā)酵而成的發(fā)酵大蒜,又稱黑蒜,無新鮮大蒜的蒜臭味及刺激性氣味,入口香甜,成為了國內(nèi)外研究的熱點。大蒜發(fā)酵過程中,自身組織破壞后,發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)和非酶褐變反應(yīng),主要包括美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)等,美拉德反應(yīng)的最終產(chǎn)物——類黑素是黑色的主要來源[1]。據(jù)報道,發(fā)酵大蒜在保留大蒜原有主要功能成分的基礎(chǔ)上,蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分更加豐富,多酚類物質(zhì)含量提高5倍以上,抗氧化能力明顯增強,生理活性更加突出[2];發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)大量轉(zhuǎn)化成為人體必需的氨基酸,對增強免疫力、消除疲勞、促進生長代謝具有重要的作用,對糖尿病、高血壓、高血脂以及癌癥等有明顯的預(yù)防和治療作用[3]。發(fā)酵大蒜研發(fā)以來,在日本、韓國、新加坡等地迅速風(fēng)靡,成為大眾推崇的保健食品之一。

    傳統(tǒng)黑蒜發(fā)酵工藝較為簡單,新鮮大蒜在高溫高濕條件下自然發(fā)酵60~90天,直到蒜瓣都變成黑色,發(fā)酵周期較長,生產(chǎn)成本較高。隨著工藝的優(yōu)化,對大蒜進行預(yù)處理和提高發(fā)酵溫度能明顯縮短發(fā)酵時間[4],對大蒜進行冷凍處理、高溫短時加熱、超聲預(yù)處理等能提高大蒜發(fā)酵過程中還原糖、總酚等物質(zhì)的含量,但預(yù)處理工藝較為繁瑣。這些工藝優(yōu)化的重點在于發(fā)酵溫度、濕度和時間等工藝參數(shù)的確定,對大蒜發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化研究不多,沒有深入研究大蒜發(fā)酵過程中各種成分的變化規(guī)律,特別是營養(yǎng)物質(zhì)、功能成分以及功能活性之間的關(guān)系。為深入研究大蒜的發(fā)酵規(guī)律,本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上,采用恒溫恒濕發(fā)酵法,重點考察大蒜發(fā)酵過程中總糖與還原糖、蛋白質(zhì)與氨基酸等營養(yǎng)成分以及總多酚與大蒜素等抗氧化物質(zhì)隨時間的變化關(guān)系,探討不同條件下發(fā)酵大蒜營養(yǎng)成分與抗氧化活性間的變化關(guān)系,對優(yōu)化發(fā)酵工藝,促進功能物質(zhì)生成,保證黑蒜品質(zhì)與功能活性具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大蒜:采購于徐州七里溝農(nóng)貿(mào)市場;大蒜素(標準品):上海源葉生物科技有限公司;乙腈(色譜純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;福林酚試劑、考馬斯亮藍、乙醇等:均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Agilent 1100高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ZH-TH-80恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 發(fā)酵大蒜的制備

    采用恒溫恒濕發(fā)酵,在溫度70 ℃、濕度80%條件下發(fā)酵,每5天取出適量大蒜進行還原糖、氨基酸、多酚等物質(zhì)含量及抗氧化活性分析。

    1.4 檢測方法

    1.4.1 大蒜多糖和還原糖的測定

    適量大蒜經(jīng)純水提取,采用苯酚-硫酸法測定多糖[5],3,5-二硝基水楊酸顯色法測定還原糖[6],根據(jù)提取液體積計算多糖和還原糖提取率。

    1.4.2 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

    適量大蒜經(jīng)純水提取多糖,粗蛋白采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[7],游離氨基酸采用茚三酮顯色法測定[8],根據(jù)提取液體積計算提取率。

    1.4.3 總多酚含量的測定

    以沒食子酸為標準物質(zhì),采用Folin-Ciocalteu法測定總多酚[9]。根據(jù)提取液體積計算提取率。

    1.4.4 大蒜素的高效液相色譜分析

    樣品提?。? g左右的大蒜加100 mL 70%乙醇,破碎,攪拌10 min,超聲波超聲提取30 min,4000 r/min離心10 min,上清液抽濾,測量提取液體積,待測。

    色譜條件:色譜柱Diamonsil Plus C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:V甲醇∶V水為80∶20;柱溫25 ℃;檢測波長254 nm;進樣量20 μL。

    以大蒜素為標準物質(zhì),配制不同濃度標準樣品進樣分析,繪制標準曲線,由標準曲線定量分析供試溶液中大蒜素的濃度,根據(jù)提取液體積計算大蒜素提取率。

    1.5 抗氧化活性分析

    1.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

    利用DPPH自由基的無水乙醇溶液呈紫色,在517 nm波長處有最大吸收,吸光度與濃度呈線性關(guān)系。加入抗氧化劑時使DPPH自由基數(shù)量減少,溶液顏色變淺,分光光度法測定吸光度變化,計算其抗氧化能力。具體測定方法參見文獻[10]。

    1.5.2 超氧自由基清除能力的測定

    在弱堿性條件下,鄰苯三酚能發(fā)生自氧化反應(yīng),生成超氧陰離子自由基和有色中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物在320 nm波長處有特征吸收峰。加入清除劑時能迅速與超氧自由基反應(yīng),從而阻止中間產(chǎn)物的積累,致使溶液吸收減弱。具體測定方法參見文獻[11]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵過程中總糖和還原糖含量的變化

    還原糖和總糖含量的高低直接影響最終產(chǎn)品的口感和變黑速率。發(fā)酵過程中每5天取樣測定蒜樣中還原糖和總糖含量,結(jié)果見圖1。

    圖1 黑蒜發(fā)酵過程中總糖和還原糖含量的變化

    由圖1可知,大蒜發(fā)酵過程中,總糖和還原糖含量均呈先逐漸上升,達到最大值之后緩慢下降的趨勢。這可能是由于在發(fā)酵過程中,大蒜中的淀粉等在淀粉酶作用下,被分解成多糖類物質(zhì),總糖含量逐漸上升,20天時達到最大;之后由于美拉德反應(yīng)加快,多糖被消耗的速率大于生成速率,導(dǎo)致含量逐漸降低。研究表明還原糖是美拉德反應(yīng)的主要物質(zhì)。大蒜發(fā)酵初期還原糖含量增長緩慢,之后迅速增加,25天時達到最大值3.768 mg/g。這可能是由于發(fā)酵初期多糖含量較低,分解速率較慢,隨著多糖含量的增加和美拉德反應(yīng)的加快,還原糖的積累逐漸增大;美拉德反應(yīng)最終生成棕色甚至黑色的類黑素物質(zhì),還原糖作為大蒜黑化反應(yīng)的前體物質(zhì)也將隨著發(fā)酵的進行而逐漸被消耗,導(dǎo)致黑蒜甜味減弱[12]。因此,為提高黑蒜品質(zhì),初期可以適當提高發(fā)酵溫度以加快還原糖的生成速率,后期適當降低發(fā)酵溫度以減緩還原糖的轉(zhuǎn)化消耗速率,從而有利于還原糖的積累和黑蒜良好口感的形成。

    2.2 發(fā)酵過程中氨基酸和蛋白質(zhì)含量的變化

    氨基酸是人體合成蛋白質(zhì)的重要原料,補充適量氨基酸對人體有著重要的作用。氨基酸含量高低直接影響發(fā)酵大蒜的品質(zhì),氨基酸大多來源于蛋白質(zhì)的分解,大蒜發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量變化見圖2。

    圖2 黑蒜發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和氨基酸含量的變化

    由圖2可知,發(fā)酵過程中,大蒜中氨基酸的含量先快速增長,25天時達到最大值2.012 mg/g,之后緩慢下降。大蒜中氨基酸量的增加主要來源于蛋白質(zhì)的分解。在發(fā)酵初期,美拉德反應(yīng)速率較慢,美拉德反應(yīng)消耗氨基酸的速率遠低于蛋白質(zhì)分解生成氨基酸的速率,因此氨基酸含量逐漸增加;隨著發(fā)酵時間的增加,美拉德反應(yīng)速率加快,氨基酸的消耗速率大大增加,導(dǎo)致氨基酸的含量逐漸降低。對大蒜中蛋白質(zhì)而言,其含量逐漸增大,30天之后增長變緩,這可能是由于大蒜中其他含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的同時存在部分蛋白質(zhì)分解為氨基酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量有所降低[13]。但發(fā)酵大蒜中氨基酸和蛋白質(zhì)的含量均高于新鮮大蒜,極大地提高了黑蒜的營養(yǎng)價值。

    2.3 發(fā)酵過程中總多酚含量的變化

    多酚是發(fā)酵大蒜中重要的功能性成分,其含量高低影響著大蒜的抗氧化功效。大蒜發(fā)酵過程中總多酚含量的變化見圖3。

    圖3 黑蒜發(fā)酵過程中總多酚含量的變化

    由圖3可知,發(fā)酵過程中,大蒜總多酚含量先緩慢增長,之后迅速增大到最大值,比新鮮大蒜中多酚含量高4.15倍。研究表明:大蒜發(fā)酵過程中大分子物質(zhì)分解生成小分子物質(zhì),能釋放出更多的酚羥基,使其多酚含量得到提高,主要為沒食子酸類化合物,具有良好的抗氧化能力[14]。發(fā)酵后期,多酚類物質(zhì)可能發(fā)生縮合反應(yīng),生成褐色物質(zhì),導(dǎo)致總多酚含量出現(xiàn)下降趨勢。

    2.4 發(fā)酵過程中大蒜素含量的變化

    大蒜素是新鮮大蒜風(fēng)味的主要標志物質(zhì),但大蒜素不穩(wěn)定,在受熱、光照等作用下容易發(fā)生降解。大蒜發(fā)酵過程中大蒜素含量的變化見圖4。

    圖4 黑蒜發(fā)酵過程中大蒜素含量的變化

    由圖4可知,發(fā)酵初期,大蒜素含量隨著大蒜的發(fā)酵迅速降低,10天后緩慢下降,發(fā)酵40天的黑蒜中大蒜素含量僅為新鮮大蒜的11%左右,幾乎沒有新鮮大蒜的刺激性氣味。研究認為,經(jīng)過長時間的發(fā)酵與熟化,不穩(wěn)定的大蒜素可能轉(zhuǎn)化為其他抗氧化能力更強的含硫化合物[15],使得發(fā)酵大蒜的體外抗氧化能力明顯高于新鮮大蒜。

    2.5 發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

    將大蒜提取液適當稀釋,分別移取不同濃度樣品做DPPH自由基和超氧自由基清除試驗,分析樣品濃度與抗氧化能力之間的關(guān)系。一般采用清除率50%時的濃度即IC50值來衡量樣品的自由基清除能力,IC50值越小,其清除自由基的能力越強,抗氧化能力也越強。發(fā)酵過程中大蒜 IC50值的變化見圖5。

    圖5 黑蒜發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

    由圖5可知,發(fā)酵大蒜提取液對DPPH自由基和超氧自由基清除能力的IC50值隨著發(fā)酵時間的延長剛開始迅速降低,而后緩慢減小,30天后IC50值下降非常緩慢,表明隨著發(fā)酵的進行,大蒜對DPPH自由基和超氧自由基的清除能力不斷增強,30天之后黑蒜的抗氧化能力幾乎達到最大,繼續(xù)發(fā)酵,抗氧化能力提高非常有限。發(fā)酵40天的黑蒜提取液對DPPH自由基和超氧自由基清除能力的IC50值分別為0.857,0.764 mg/mL,抗氧化能力是新鮮大蒜的11.25倍和9.22倍。實驗發(fā)現(xiàn),黑蒜提取液對DPPH自由基和超氧自由基清除效果與樣品濃度之間呈較明顯的量效關(guān)系,樣品濃度越大,清除率越高;發(fā)酵15天之后,黑蒜提取液濃度最大時對DPPH自由基和超氧自由基的清除率均大于90%,表明黑蒜具有良好的抗氧化能力。研究認為,大蒜發(fā)酵過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的氨基酸、糖類、多酚以及含硫化合物等量的增加是抗氧化能力顯著提高的根本原因[16]。

    2.6 發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量與抗氧化活性間的相關(guān)性分析

    采用SPSS 23.0計算大蒜發(fā)酵過程中各物質(zhì)含量與抗氧化活性間的相關(guān)性,見表1。

    表1 黑蒜發(fā)酵過程中物質(zhì)含量與抗氧化活性間的相關(guān)性分析

    注:“*”表示顯著相關(guān),P<0.05;“**”表示極顯著相關(guān),P<0.01。

    由表1可知,超氧自由基清除能力的IC50值與DPPH自由基清除能力的IC50值呈極顯著正相關(guān)(r=0.976,P<0.01),大蒜素的含量與DPPH自由基清除能力的IC50值呈極顯著正相關(guān)(r=0.992,P<0.01),而總糖、還原糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、總多酚等物質(zhì)含量與DPPH自由基清除能力的IC50值呈負相關(guān)。由于IC50值與自由基清除能力呈負相關(guān)關(guān)系,則總糖、還原糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、總多酚等物質(zhì)含量與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān),其中蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖等物質(zhì)含量與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與多酚含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖、多酚是發(fā)酵大蒜中最主要的抗氧化成分,為提高發(fā)酵大蒜的抗氧化能力,應(yīng)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù),綜合考慮,盡可能提高這些成分的含量。

    3 結(jié)論

    恒溫恒濕條件下發(fā)酵大蒜,重點考察了發(fā)酵過程中總糖和還原糖、蛋白質(zhì)與氨基酸、多酚與大蒜素等物質(zhì)隨時間的變化規(guī)律。結(jié)果表明:大蒜外觀顏色隨發(fā)酵時間的延長逐漸變黑,新鮮大蒜特有的刺激性氣味和辛辣味逐漸減弱,到最后幾乎沒有。總糖和還原糖含量均先上升后緩慢下降,碳水化合物的積累使得發(fā)酵大蒜具有一定的甜度,增強了口感。大蒜發(fā)酵過程中其他含氮化合物轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的同時,蛋白質(zhì)大量分解產(chǎn)生了包含人體必需的游離氨基酸,使得發(fā)酵大蒜中氨基酸和蛋白質(zhì)的含量明顯高于新鮮大蒜,大大提高了大蒜的營養(yǎng)價值??偡雍康娘@著增加賦予了發(fā)酵大蒜更強的抗氧化性。相關(guān)性分析表明:蛋白質(zhì)、氨基酸、還原糖和總酚含量與發(fā)酵大蒜抗氧化能力呈顯著正相關(guān),是發(fā)酵大蒜中最主要的抗氧化物質(zhì)。因此,發(fā)酵大蒜是一種具有良好抗氧化功能的營養(yǎng)保健食品,發(fā)酵過程是一系列物理化學(xué)反應(yīng)共同作用的結(jié)果,應(yīng)根據(jù)各物質(zhì)含量的變化規(guī)律合理控制發(fā)酵溫度、濕度和時間,進一步優(yōu)化大蒜發(fā)酵工藝參數(shù),以達到最佳的產(chǎn)品外觀、口感、營養(yǎng)成分和功能活性。

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