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    LAMP和熒光定量PCR檢測(cè)食品中致病微生物的對(duì)比分析

    2018-10-20 01:54:46廣州市黃埔區(qū)疾病預(yù)防控制中心510700鐘秀茵楊曉斌劉鈺釵何湘鵑
    首都食品與醫(yī)藥 2018年1期
    關(guān)鍵詞:沙門(mén)埃希菌金黃色

    廣州市黃埔區(qū)疾病預(yù)防控制中心(510700)鐘秀茵 楊曉斌 劉鈺釵 何湘鵑

    附圖1 LAMP反應(yīng)后可見(jiàn)沉淀,1、2為沙門(mén)菌,3、4為大腸埃希菌,5、6、7為金黃色葡萄球菌。LAMP反應(yīng)后凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)連續(xù)階梯狀條帶,M為DNA標(biāo)記,1、2為沙門(mén)菌,3、4為大腸埃希菌,5、6、7為金黃色葡萄球菌

    附圖2 熒光定量PCR反應(yīng)后目的基因溶解曲線

    食源性疾病主要是指食品中致病微生物進(jìn)入人體中而引發(fā)的感染性或中毒性疾病[1]。本次研究采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)各類(lèi)食物標(biāo)本中的3種致病微生物進(jìn)行檢測(cè),對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行比較,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 基本資料 選取攜帶有致病微生物的50份米粉、50份污水及50份罐頭作為檢測(cè)樣本,分別在檢測(cè)樣本中接種濃度為10cfu/ml的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌等菌株(均由本實(shí)驗(yàn)室保存,并接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,在37℃環(huán)境下培養(yǎng)18小時(shí)后,反復(fù)轉(zhuǎn)接3次后即可作為備用)各1ml,其中,米粉10g(雀巢高蛋白奶麥粉、鐵鋅鈣營(yíng)養(yǎng)米粉、魚(yú)肉蔬菜營(yíng)養(yǎng)米粉等),污水樣本取自本地區(qū)湖水,污水需稱(chēng)量7ml,罐頭10g(亨氏水果泥、蔬菜骨泥、三文魚(yú)番茄罐頭等)。

    1.2 方法 采用LAMP技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)對(duì)檢測(cè)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè),比較兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果。

    附表 LAMP與熒光定量PCR對(duì)各樣本致病微生物的檢測(cè)結(jié)果比較(n,%)

    1.2.1 LAMP檢測(cè) 試劑及儀器分別為DNA抽提試劑盒、化學(xué)試劑(包括MgSO4、NH4SO4、KCI溶液等)、凝膠電泳儀,金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌各設(shè)計(jì)4條引物(即F3、B3、FIP、BIP),合成于上海生物工程公司;在消毒樣品包裝的開(kāi)啟和取樣勺后,稱(chēng)取藥品,加入蒸餾水90ml后混勻,并培養(yǎng)24h,將樣品溶液置于肉湯中,混勻培養(yǎng)24h,隨后取增菌液500μl置于無(wú)菌離心管,離心后棄上清液,加入80μl核酸提取液,沸水浴10min后冷卻,再離心2min取上清液為后續(xù)反應(yīng)模版,使用LAMP對(duì)上清液進(jìn)行擴(kuò)增,孵育1小時(shí)后在80℃下孵育5min,結(jié)束反應(yīng),設(shè)置對(duì)照。反應(yīng)管內(nèi)加入SYBR GreenI 1μl,混勻后于黑色背景下反應(yīng)觀察。陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液為綠色、陰性為橘色,則檢測(cè)結(jié)果有效,在此前提下樣品反應(yīng)液為綠色,則為陽(yáng)性[2]。

    1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè) 試劑及儀器分別為DNA抽提試劑盒、定量反應(yīng)配套試劑盒、核酸蛋白分析儀、定量聚合酶鏈反應(yīng)儀,金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),金黃色葡萄球菌引物正向、反向基因序列分別為CATTGGCCAAGCGAGACGAAC、AAAGGGCAAGACGCAAAGAGGT,大腸埃希菌引物正向、反向基因序列分別為T(mén)GATAGCTGCACTCGAATCC、GTAGCCTATAACGTCATGCC,沙門(mén)菌引物正向、反向基因序列分別為T(mén)CATGGGACCCTCATTGGATCC、GTGTTTTTCGCCACGAACGCCCAT;定量PCR擴(kuò)增采用定量反應(yīng)配套試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,擴(kuò)增反應(yīng)采用二步法進(jìn)行,先在95℃下預(yù)變性反應(yīng)10min,再在95℃下擴(kuò)增20s,在60℃下反應(yīng)1min,共反應(yīng)40個(gè)循環(huán),再采用DNA抽提試劑盒對(duì)細(xì)菌的總DNA進(jìn)行提取,如凝膠電泳結(jié)果中可見(jiàn)各致病菌的目的條帶即為陽(yáng)性,反之則為陰性[3]。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料(n,%)進(jìn)行χ2檢驗(yàn),以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 LAMP檢測(cè)結(jié)果 成功建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的LAMP,說(shuō)明LAMP對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高;LAMP反應(yīng)后肉眼可見(jiàn)明顯綠色,凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)連續(xù)階梯狀條帶(見(jiàn)附圖1),說(shuō)明其引物特異性均較為良好。

    2.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 成功建立檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的熒光定量PCR,說(shuō)明其對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高;熒光定量PCR反應(yīng)后凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)目的條帶(金黃色葡萄球菌目的條帶大小為484bp,大腸埃希菌目的條帶大小為662bp,沙門(mén)菌目的條帶大小為284bp),目的基因溶解曲線(見(jiàn)附圖2),說(shuō)明其引物特異性均較為良好。

    2.3 LAMP與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果比較熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)三類(lèi)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢出率均高于LAMP檢測(cè),但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)附表。

    3 討論

    食品微生物檢驗(yàn)是食品安全檢查的重要環(huán)節(jié),通過(guò)對(duì)食品中的致病微生物進(jìn)行檢驗(yàn),可有效檢出食品中的致病微生物。食品中的致病微生物主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌,而采取何種檢測(cè)技術(shù)對(duì)其有效檢出尚有待探討。

    LAMP技術(shù)是近年來(lái)在食源性致病微生物檢測(cè)中應(yīng)用較多的一種技術(shù),主要是利用特殊性能的DNA聚合酶設(shè)計(jì)引物,引物在靶序列DNA區(qū)可進(jìn)行雜交,合成互補(bǔ)鏈,進(jìn)而生成DNA產(chǎn)物,通過(guò)肉眼可對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定,同時(shí),由于LAMP反應(yīng)條件僅需60℃恒溫條件,無(wú)需特殊的儀器設(shè)備,僅需溫度循環(huán)儀器設(shè)備即可,其操作較為便利,結(jié)果判讀較為方便[4]。熒光定量PCR技術(shù)是一種新型的微生物檢驗(yàn)技術(shù),在食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛,由于部分病原微生物具有高度變異性,在檢驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,而熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)病原微生物進(jìn)行定量檢測(cè),從而可有效規(guī)避其假陽(yáng)性結(jié)果,檢測(cè)準(zhǔn)確性較高[5]。本次研究中,LAMP、熒光定量PCR均成功建立金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢測(cè),說(shuō)明二者對(duì)致病微生物的檢測(cè)靈敏度較高,且LAMP反應(yīng)后可見(jiàn)明顯渾濁或沉淀,熒光定量PCR反應(yīng)后可見(jiàn)目的基因溶解曲線呈單一曲線,說(shuō)明二者引物的特異性均較為良好。此外,本次研究還發(fā)現(xiàn),熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)三類(lèi)樣本中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌檢出率均高于LAMP檢測(cè),但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這提示我們這兩種檢測(cè)技術(shù)均具有較高的準(zhǔn)確性,可將二者結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。

    綜上所述,LAMP技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)用于食品中致病微生物檢測(cè)均具有良好的檢測(cè)效果,具有其各自?xún)?yōu)勢(shì),在實(shí)際工作中,應(yīng)將二者結(jié)合進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè),以提高食品中致病微生物的檢出率,促進(jìn)食品安全。

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