DNA-微陣列芯片法檢驗結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價值

徐微

吉林省結(jié)核病醫(yī)院檢驗科，吉林長春 130500

非結(jié)核分枝桿菌是指結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌與牛分枝桿菌以外的分枝桿菌，其特征與結(jié)核分枝桿菌有明顯差異，現(xiàn)已備受各界學者的關(guān)注[1]。目前，臨床主要通過抗酸染色法、羅氏法等進行結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌診斷，然而抗酸染色法鑒別效果較差，羅氏法雖然準確率較高，但檢驗時間長、操作復雜，無法為患者早期診療工作提供保障[2]。因此，探尋一種快速、準確的檢驗方法鑒別各類型分支桿菌十分必要。該研究隨機選擇2016年12月—2018年3月該院痰結(jié)核培養(yǎng)或結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性標本108份，采用博奧生物有限公司生產(chǎn)的DNA-微陣列芯片法進行檢驗，并與改良羅氏法與測序法對比，探討DNA-微陣列芯片法對結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇該院痰結(jié)核培養(yǎng)或結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性標本108份，其中痰培養(yǎng)陽性48份，痰涂片陽性60份。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 主要儀器：E-Cycler96梯度PRC儀，BioMixerII芯片雜交儀，Extractor36核酸快速提取儀，Luxscan10K-B微陣列芯片掃描儀。試劑：噻吩-2-羧酸肼、對硝基苯甲酸與改良羅氏培養(yǎng)基均由天津金章科技發(fā)展有限公司提供，DNA-微陣列芯片分枝桿菌菌種鑒定試劑盒由北京博奧生物有限公司提供。

1.2.2 檢驗方法 108份標本均采用改良羅氏培養(yǎng)法、DNA-微陣列芯片法檢驗，對二者檢驗結(jié)果不一致的標本進行測序，并將結(jié)果作為檢驗的金標準。⑴改良羅氏培養(yǎng)法：通過對硝基苯甲酸生長實驗初步鑒定菌種，識別出的結(jié)核分枝桿菌菌株，并以絕對濃度法給予分枝桿菌藥物敏感檢驗。試驗方法根據(jù)中國防癆協(xié)會制定的 《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》執(zhí)行。⑵DNA-微陣列芯片法檢驗：根據(jù)試劑說明書中的標準進行相關(guān)操作。①核酸提取：選取核酸提取液80 μL并置于提取管中，加入無菌接種環(huán)挑取的涂片陽性痰液或培養(yǎng)陽性菌落。通過核酸快速提取儀進行震蕩，時間為5 min，再以90℃水浴 5 min，速度5 000 rpm離心1 min，取出核酸放置在-20℃的冰箱內(nèi)待檢。②PCR擴增：在每個樣品上設(shè)置3個復孔，并實施擴增反應(yīng)。在200 μL離心管內(nèi)加入PCR擴增試劑1～3各18 μL，并在3個離心管內(nèi)加入包含待檢樣品DNA的核酸提取管內(nèi)上清液2 μL，放置在PCR擴增儀中，根據(jù)說明書內(nèi)的熱循環(huán)流程給予PCR擴增。PCR引物序列均由博奧生物有限公司提供，其中PCR擴增試劑1～3擴增分別為分枝桿菌屬探針序列，rpoB基因突變位點序列，inhA與katG基因突變位點序列。③芯片雜交：加熱雜交緩沖液，溫度控制在50℃，待其完全融化合混勻后，分別取9 μL放置在2管內(nèi)。各取3 μL PCR1與2產(chǎn)物加入上述2個雜交緩沖液管內(nèi)，配制成混合物R。各取3 μL PCR1與3產(chǎn)物配制混合物H。加熱雜交混合物，溫度為95℃，使其變性5 min，之后冰浴3 min。在加樣孔內(nèi)加入13.5 μL混合物，微陣列1加入混合物R，微陣列2加入H，密封放置在溫水（50℃）浴鍋內(nèi)120 min。④洗滌與干燥：拆開雜交盒，取出芯片放置在包含芯片洗滌液Ⅰ的容器內(nèi)，以80～100 rpm的速度恒溫振蕩，洗滌3 min。之后以80～100 rpm的速度恒溫振蕩芯片洗滌液Ⅱ，洗滌3 min。最后將芯片放置在離心機內(nèi)，以800 rpm的速度離心5 min，甩干后掃描。⑤掃描與結(jié)果讀?。和ㄟ^微陣列芯片掃描儀與相關(guān)軟件讀取信號與結(jié)果。⑶測序：將改良羅氏培養(yǎng)與DNA-微陣列芯片法檢驗不一致的標本進行DNA序列檢驗，利用博奧生物有限公司生產(chǎn)試劑盒中的引物作為測序上下游引物。

1.3 觀察指標

將測序結(jié)果作為金標準，評價改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別效果。改良羅氏培養(yǎng)法鑒別標準：選取羅氏培養(yǎng)基上單個菌落實施噻吩-2-羧酸肼與對硝基苯甲酸檢驗，當噻吩-2-羧酸肼（+），對硝基苯甲酸（-）時為結(jié)核分枝桿菌；當噻吩-2-羧酸肼（+），對硝基苯甲酸（+）時為非結(jié)核分枝桿菌。DNA-微陣列芯片法鑒別標準：按照芯片上探針在特定位置的排布，讀取受檢細胞的信息，繼而鑒定出分枝桿菌菌種。

1.4 統(tǒng)計方法

該研究數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件分析，計數(shù)資料采用[n（%）]表示，以 χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

108份標本經(jīng)測序結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌26份，非結(jié)核分枝桿菌82份。經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)法檢驗，鑒定為結(jié)核分枝桿菌25份，非結(jié)核分枝桿菌80份；經(jīng)DNA-微陣列芯片法檢驗，鑒定為結(jié)核分枝桿菌24份，非結(jié)核分枝桿菌79份，其中包括戈登分枝桿菌16份，胞內(nèi)分枝桿菌30份，堪薩斯分枝桿菌10份，偶然分枝桿菌5份，復合群鳥分枝桿菌10份，無法讀取8份。經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)法檢驗對結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的準確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 改良羅氏法、DNA-微陣列芯片法對結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別效果對比[n（%）]

3 討論

分枝桿菌屬于細菌的一大類，其包含不同的細菌菌種，結(jié)核分枝桿菌可導致人類罹患結(jié)核病，非結(jié)核分枝桿菌則是分枝桿菌類目下的細菌，不是導致結(jié)核病的原因[3]。近年來，非結(jié)核分枝桿菌的感染率顯著攀升，且感染種類也不斷增加，現(xiàn)已備受臨床學者的關(guān)注[4]。由于致病性非結(jié)核分枝桿菌感染與結(jié)核病癥狀相似，均存在全身癥狀與局部損害，且二者影像學表現(xiàn)十分相近，極易發(fā)生誤診，延誤治療時機[5]。

目前，改良羅氏法是鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌的主要檢驗方法，可以直觀觀察到細菌的生長。然而，部分研究發(fā)現(xiàn)，改良羅氏法易受菌齡、菌量與受檢者主觀因素的影響，加之檢驗周期長（通常從患者就診到獲取到敏感結(jié)果需要2～3個月）、操作復雜，無法為患者提供早期診斷依據(jù)[6-7]。目前，分子生物學技術(shù)是熱門的快速檢驗方法。DNA-微陣列芯片法與線性探針相似，其技術(shù)特點是通過設(shè)計PCR擴增引物與寡核苷酸探針，在芯片表現(xiàn)上固定，并經(jīng)與針對性擴增受檢樣本的DNA片段雜交，利用芯片掃描儀對雜交后的芯片熒光信號進行掃描，繼而讀取出菌種信息[8]。同時，DNA-微陣列芯片可在6 h得出檢驗結(jié)果，操作簡單、快速，并能夠同時鑒別17種分枝桿菌，有效保證了患者的治療時機。學者何建[9]對125例結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性標本與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性標本，應(yīng)用了DNA微陣列芯片法檢測耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對異煙肼耐藥的一致率為98.8%，對利福平的一致率為99.4%，并認為DNA微陣列芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性效果可靠，且用時短，可用于臨床篩查。學者何莉等[10]對64例改良羅氏法陽性分枝桿菌核酸應(yīng)用了DNA-微陣列芯片法檢測，并以測序法作為金標準，結(jié)果顯示兩種方法檢測的一致率為93.8%，非結(jié)核分枝桿菌一致率95.8%，結(jié)核分枝桿菌一致率87.5%。該文研究結(jié)果與上述結(jié)果相符，改良羅氏培養(yǎng)法對結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌檢驗的準確率為96.15%、97.56%，與DNA-微陣列芯片92.31%、96.34%對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 可見，DNA-微陣列芯片與改良羅氏法鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的效果相當，但DNA-微陣列芯片的檢驗速度更快，為臨床診療提供了有利的參考。108份標本中，DNA-微陣列芯片菌種顯示無法讀取5份，其中4份樣本在偶然分枝桿菌熒光探針處肉眼觀察到微弱的熒光信號，但因背景過亮，干擾了信號值的讀??；1份樣本不僅背景過亮，且熒光存在雜質(zhì)，導致熒光信號極弱。究其原因可以與以下幾項有關(guān)：①開始加樣-干燥芯片的某個環(huán)節(jié)中，芯片微陣列液體直接暴露在空氣中過久，樣本過于干燥而提高了芯片背景亮度；②實驗樣本受到污染，導致芯片背景存在雜質(zhì)；③核酸濃度差異對結(jié)果讀取造成了干擾[10]。

綜上所述，DNA-微陣列芯片法在結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌檢驗中具有較高的準確率，且操作簡單、快速，臨床應(yīng)用價值顯著，適于推廣。