基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)代謝標(biāo)志物的篩選

吳靜，楊睿，張磊，康華，范志娟，劉樹業(yè)△

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居?jì)D女各類惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康［1-2］。盡管近年來(lái)乳腺癌的診斷方法和治療技術(shù)不斷提高［3］，但乳腺癌患者的死亡率仍然高居不下。乳腺癌轉(zhuǎn)移是患者死亡的最主要原因［4］，而目前針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療仍沒有進(jìn)展。

表觀遺傳學(xué)突變導(dǎo)致的代謝表型異常是乳腺癌發(fā)生的重要因素。代謝組（即小分子代謝物群）是某一生物、系統(tǒng)或細(xì)胞在特定狀態(tài)下的所有代謝產(chǎn)物的集合，也是基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組綜合作用下的最終產(chǎn)物［5］。在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段，構(gòu)成代謝組的小分子代謝物的種類或濃度均會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化［6］。乳腺癌轉(zhuǎn)移早，發(fā)展迅速，甚至在乳腺癌發(fā)展初期就已出現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶。因此，如能篩選出與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的代謝物作為生物標(biāo)志物，對(duì)及時(shí)判斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移趨勢(shì)、把握患者治療時(shí)機(jī)和提高生存率有重要意義。因此，本研究應(yīng)用基于高分辨率的高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-LTQ Orbitrap XL MS）分析平臺(tái)的代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)乳腺癌未轉(zhuǎn)移和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的血清樣本進(jìn)行代謝輪廓差異分析，并從中篩選出與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝標(biāo)志物，為乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估以及藥物靶點(diǎn)的研究等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 收集2015年1月—2017年9月天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科100例乳腺癌患者的血清標(biāo)本，包括未轉(zhuǎn)移組50例，年齡33～64歲，平均（54±9）歲；轉(zhuǎn)移組50例，年齡37～66歲，平均（58±14）歲，轉(zhuǎn)移組中肝轉(zhuǎn)移19例、肺轉(zhuǎn)移22例、骨轉(zhuǎn)移9例。入選標(biāo)準(zhǔn)：自愿進(jìn)入本研究并簽署書面知情同意書；病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)上明確診斷為乳腺癌；體力狀態(tài)Karnofsky評(píng)分≥60分，預(yù)計(jì)生存期在3個(gè)月以上。未轉(zhuǎn)移組：原發(fā)乳腺癌，伴有鄰近組織浸潤(rùn)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移組：原發(fā)乳腺癌，經(jīng)檢查示有遠(yuǎn)隔淋巴結(jié)、肝、肺或骨轉(zhuǎn)移；既往接受過1或2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但治療無(wú)效或復(fù)發(fā)進(jìn)展。收集同期50例健康志愿者，年齡30～59歲，平均（50±16）歲，收集血清作為對(duì)照標(biāo)本。所有標(biāo)本經(jīng)過收集分裝后-80℃保存，分析前室溫解凍。3組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.856，P=0.051）。

1.2 儀器與試劑 LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀和Accela高效液相色譜儀（HPLC）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸（HPLC純）購(gòu)于上海南翔人民化工廠；乙腈（HPLC純）購(gòu)于德國(guó)Merck公司；蒸餾水經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）過濾后使用；實(shí)驗(yàn)所需標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本預(yù)處理 取解凍后的血清標(biāo)本100 μL與400 μL甲醇混合，劇烈震蕩30 s，4℃靜置5 min后4℃、15 000×g離心30 min，取上清液，真空離心蒸干得干粉。將干粉用等樣本體積的水與乙腈混合溶液（V/V=95/5）重溶，再以4 ℃、15 000×g離心30 min取上清液，將上清液用0.22 μm孔徑濾膜過濾后進(jìn)行上樣檢測(cè)。以各標(biāo)本上樣液等體積混合后的溶液（Pool溶液）作為質(zhì)控品（QC）參與分析。

1.3.2 樣品分析 HPLC的色譜柱為Thermo Hypersil GOLD柱（50 mm×2.1 mm×1.9 μm）；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流速為200 μL/min。梯度洗脫程序：0～3 min，5%B；3～10 min，5%B線性增加至50%B；10～13 min，50%B 線性增加至 95%B；13～17 min，95%B；17～21 min，95%B～5%B；21～25 min，5%B，平衡色譜柱。進(jìn)樣量為10 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度維持在4℃。LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜系統(tǒng)配有電噴霧離子源（ESI）；采用正離子Centroid模式進(jìn)行掃描檢測(cè)；毛細(xì)管電壓7 V，錐孔電壓50 V，離子源電壓4.8 kV；數(shù)據(jù)采集范圍質(zhì)荷比（m/z）50～1 000，分辨率為60 000。質(zhì)量校正使用廠家提供的校正液，并根據(jù)用戶手冊(cè)說明進(jìn)行。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中共檢測(cè)24個(gè)質(zhì)控溶液：樣品分析前連續(xù)分析10個(gè)質(zhì)控溶液，其余14個(gè)隨機(jī)插入到所有樣品的分析序列中。樣品分析的先后順序由Excel自帶函數(shù)隨機(jī)產(chǎn)生。每個(gè)樣品（包括質(zhì)控溶液）分析后均插入空白分析，避免交叉污染。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理和分析 將HPLC-LTQ Orbitrap XL平臺(tái)分析得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到MZmine 2.7.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理［7］，包括濾噪、峰識(shí)別、重疊峰解析、峰對(duì)齊、峰補(bǔ)齊和標(biāo)準(zhǔn)化（以每個(gè)樣品的總峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)化因子）等。去除缺失值≥80%的變量，然后采用MZmine自帶方法給缺失值少的變量賦值。分析得到一個(gè)二維（i×j）峰表，每一行（i）代表一個(gè)樣本，每一列（j）代表一個(gè)變量，數(shù)值則表示相應(yīng)的離子強(qiáng)度。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMCA 14.1軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行分析。

為找到鑒別乳腺癌轉(zhuǎn)移與否和進(jìn)展程度的特異性代謝標(biāo)志物，按照“健康對(duì)照組-乳腺癌未轉(zhuǎn)移組-乳腺癌轉(zhuǎn)移組”的順序，將“健康對(duì)照組和乳腺癌未轉(zhuǎn)移組”、“乳腺癌未轉(zhuǎn)移組和乳腺癌轉(zhuǎn)移組”進(jìn)行兩兩組合對(duì)比。通過SIMCA14.1軟件構(gòu)建主成分分析（PCA）模型，并對(duì)以上2個(gè)組合分別構(gòu)建正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）［8］和S-plot模型，通過S-plot模型篩選出差異表達(dá)代謝物（其中藍(lán)點(diǎn)代表差異表達(dá)代謝物，對(duì)模型的貢獻(xiàn)大和穩(wěn)健性強(qiáng)）。隨機(jī)選取各組的80%樣本作為訓(xùn)練集建立OPLS-DA模型，剩余20%的樣本作為檢測(cè)集評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性。潛在標(biāo)志物根據(jù)變量重要性（variable importance in the projection，VIP）預(yù)測(cè)值、VIP置信區(qū)間進(jìn)行初步篩選，然后利用SPSS 16.0軟件（美國(guó)）對(duì)所得代謝物進(jìn)行獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，排除P≥0.05的代謝物。

1.3.4 潛在代謝標(biāo)志物的鑒定 首先根據(jù)篩選出的變量重新設(shè)定儀器參數(shù)，對(duì)質(zhì)控溶液進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描，獲得代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖；然后利用精確質(zhì)荷比（m/z）和二級(jí)質(zhì)譜圖搜索Mass Frontier 6.0自帶數(shù)據(jù)庫(kù)、Medlin數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)以及HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過結(jié)構(gòu)推導(dǎo)得出初步結(jié)果；最后通過與標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS質(zhì)譜圖對(duì)比得到鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HPLC-LTQ Orbitrap XL分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性 采用HPLC-MS平臺(tái)對(duì)獲取的乳腺癌未轉(zhuǎn)移患者、乳腺癌轉(zhuǎn)移患者和健康人血清樣品分析后的總離子流圖（TIC）如圖1所示。對(duì)24個(gè)質(zhì)控溶液數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析后發(fā)現(xiàn)，HPLC-MS系統(tǒng)在整個(gè)分析過程中均比較穩(wěn)定，見圖2。

Fig.1 Total ion chromatograms of(a)a healthy person,(b)a breast cancer patient without metastasis and(c)a breast cancer patient with metastasis圖1 典型（a）健康人、（b）乳腺癌未轉(zhuǎn)移患者和（c）乳腺癌轉(zhuǎn)移患者的總離子流圖

Fig.2 PCA score plot(t［1］/sample)of the quality control(QC)samples圖2 質(zhì)控溶液樣本PCA打分線性圖

2.2 代謝輪廓分析對(duì)疾病狀態(tài)的區(qū)分能力 對(duì)樣本進(jìn)行PCA分析后結(jié)果如圖3所示，健康對(duì)照組得到了區(qū)分，而乳腺癌未轉(zhuǎn)移組和乳腺癌轉(zhuǎn)移組未能區(qū)分開。為其構(gòu)建OPLS-DA模型，結(jié)果顯示健康對(duì)照組、乳腺癌未轉(zhuǎn)移組、乳腺癌轉(zhuǎn)移組樣本得到了很好的區(qū)分，并且該模型具有很好的擬合性（R2=95.2%）和預(yù)測(cè)能力（Q2=86.7%），見圖4。為進(jìn)一步檢測(cè)該模型的可靠性，隨機(jī)選取每組80%樣本作為訓(xùn)練集構(gòu)建OPLS-DA模型（R2=93.5%，Q2=79.8%），用剩余的20%樣本作為檢測(cè)集檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膮^(qū)分能力，預(yù)測(cè)正確率達(dá)95.62%，見圖5。

Fig.3 PCA score plot for all samples圖3 基于所有樣本的PCA打分圖

Fig.4 OPLS-DA score plot for all samples圖4 基于所有樣本的OPLS-DA打分圖

2.3 潛在代謝標(biāo)志物的篩選和鑒定 對(duì)“健康對(duì)照組和乳腺癌未轉(zhuǎn)移組”、“乳腺癌未轉(zhuǎn)移組和乳腺癌轉(zhuǎn)移組”2個(gè)組合分別構(gòu)建的OPLS-DA模型見表1，通過構(gòu)建S-plot模型（圖6）篩選出差異表達(dá)代謝物（藍(lán)點(diǎn)），并對(duì)篩選出的代謝物進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，進(jìn)一步排除P≥0.05的代謝物，而P＜0.05的代謝物則可能是潛在的代謝標(biāo)志物，見表2。

Fig.5 OPLS-DA scores plot for testing group圖5 基于檢測(cè)組樣本的OPLS-DA打分圖

Tab.1 Two OPLS-DA models constructed by two different com binations of the sam p les表1 不同樣本組組合構(gòu)建的2個(gè)OPLS-DA模型 （%）

Fig.6 S-plot model constructed by healthy persons and breast cancer patients without metastasis圖6 基于健康對(duì)照組和乳腺癌未轉(zhuǎn)移組構(gòu)建的S-plot模型圖

篩選出來(lái)的潛在代謝標(biāo)志物按照1.3.4所述進(jìn)行鑒定，通過二級(jí)質(zhì)譜圖搜索和標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)，健康對(duì)照組和乳腺癌未轉(zhuǎn)移組共篩選出31個(gè)差異表達(dá)代謝物（P＜0.05），其中24個(gè)得到了初步鑒定。乳腺癌未轉(zhuǎn)移組和乳腺癌轉(zhuǎn)移組共篩選出23個(gè)差異表達(dá)代謝物（P＜0.05），其中15個(gè)得到了初步鑒定（表2）。在鑒定出的39個(gè)代謝物中，有8個(gè)代謝物［包括溶血磷脂酸（18∶1）、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）、溶血磷脂酰膽堿（20∶3）、膽堿、磷酸二羥丙酮、番石榴酸、芥酸、L-氫化乳清酸］的表達(dá)水平隨著乳腺癌的進(jìn)展（從健康人到未轉(zhuǎn)移的乳腺癌再發(fā)展到已轉(zhuǎn)移的乳腺癌）是逐漸升高的。

3 討論

3.1 代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)所有代謝物的一種新興技術(shù) 代謝組學(xué)作為后基因組時(shí)代的一種全新的組學(xué)技術(shù)，利用高分離效率、高敏感度、高通量及極低檢測(cè)限的儀器，以生物體內(nèi)小分子化合物的動(dòng)態(tài)規(guī)律變化來(lái)表征生物體的生理病理變化趨勢(shì)，從而揭示疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的異常的代謝機(jī)制［9］。因此，代謝組學(xué)被廣泛應(yīng)用于疾病診斷［10］、新藥研究與開發(fā)［11］、藥物作用機(jī)制研究［12］等多個(gè)領(lǐng)域。

3.2 代謝組學(xué)技術(shù)在篩選乳腺癌標(biāo)志物方面的意義 研究證實(shí)，乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展與代謝異常密切相關(guān)［13］，而常規(guī)檢測(cè)與研究中又缺乏高敏感性和高特異性的腫瘤標(biāo)志物。因此，代謝組學(xué)作為一種新型的研究技術(shù)，可以分析乳腺癌發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生的所有代謝物的變化，識(shí)別有價(jià)值的潛在標(biāo)志物，為腫瘤的早期診治開辟新途徑。近年來(lái)，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)在乳腺癌標(biāo)志物的篩選方面也取得了很大的進(jìn)展［14］。然而針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移代謝標(biāo)志物的篩選和研究甚少，因此還無(wú)法完滿地解釋乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

3.3 應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)篩選出與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物 基于此，本研究應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)分析了健康對(duì)照組、乳腺癌未轉(zhuǎn)移組和乳腺癌轉(zhuǎn)移組患者血清樣本的代謝輪廓差異，初步篩選和鑒定了可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展相關(guān)的8個(gè)代謝物，包括溶血磷脂酸（18∶1）、溶血磷脂酰膽堿（18∶0）、溶血磷脂酰膽堿（20∶3）、膽堿、磷酸二羥丙酮、番石榴酸、芥酸、L-氫化乳清酸。這些代謝物的表達(dá)水平隨著乳腺癌進(jìn)展逐漸升高，它們參與的代謝過程包括磷脂代謝［15］（如溶血磷脂酰膽堿、膽堿）、脂質(zhì)代謝（如溶血磷脂酸）、核苷酸代謝（如L-氫化乳清酸）、脂肪酸代謝（如芥酸）、糖代謝（如磷酸二羥丙酮、番石榴酸）等，而涉及的生物學(xué)過程則包括了能量代謝、蛋白質(zhì)的合成和降解、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與降解等。

3.4 潛在代謝標(biāo)志物的生物學(xué)意義 本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌在發(fā)展進(jìn)程中的代謝變化主要表現(xiàn)為磷脂代謝的紊亂。溶血磷脂酰膽堿是卵磷脂在磷脂酶A2作用下的水解產(chǎn)物，參與體內(nèi)的磷脂代謝。在正常情況下，人體內(nèi)的卵磷脂可以從動(dòng)植物中獲取，也可以通過膽堿在體內(nèi)合成。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與溶血磷脂酰膽堿［16］、膽堿［17］的含量升高相關(guān)，而乳腺癌患者中膽堿水平的升高又與Wnt/β-caternin通路發(fā)生異常有關(guān)［17］。本研究也發(fā)現(xiàn)乳腺癌在轉(zhuǎn)移進(jìn)展的過程中溶血磷脂酰膽堿和膽堿的含量均明顯高

于正常人（表2），其內(nèi)在的發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步探討。Concei??o等［18］發(fā)現(xiàn)，與良性乳腺疾病患者相比，乳腺癌患者的血清和組織樣本中的芥酸水平顯著增加，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明在乳腺癌進(jìn)展過程中也可能發(fā)生了脂肪酸代謝的紊亂。溶血磷脂酸是脂質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)增殖［19］、遷移［20］、血管生成［21］和轉(zhuǎn)移［16］。而本研究也證實(shí)乳腺癌在轉(zhuǎn)移過程中的溶血磷脂酸水平升高。因此通過拮抗溶血磷脂酸的合成、阻斷其代謝途徑和抑制其信號(hào)傳導(dǎo)可望成為抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的新方向。

Tab.2 Selected and identified potential metabolic biom arkers associated with breast cancer metastasis表2 乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)潛在代謝標(biāo)志物的篩選及初步鑒定結(jié)果

總之，由以上結(jié)果可以看出，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可以很好地區(qū)分乳腺癌轉(zhuǎn)移患者、乳腺癌未轉(zhuǎn)移患者和健康人的代謝輪廓，并且成功地發(fā)現(xiàn)并初步鑒定出與乳腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展相關(guān)的代謝標(biāo)志物，為乳腺癌的早期診治、預(yù)后評(píng)估和藥物治療靶點(diǎn)的選擇提供新的思路和方法。下一步我們將對(duì)乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制和相關(guān)代謝通路做進(jìn)一步研究。