LC-MS/MS法分析人血漿中西格列汀濃度及其應(yīng)用研究

劉珊珊，夏媛媛，劉靜媛，耿雅杰，魏廣力，司端運(yùn)△

糖尿病是由胰島素分泌過少或作用缺陷引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，病因復(fù)雜。西格列汀是世界上首個(gè)上市的二肽激肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，通過抑制血清DPP-Ⅳ的活性，達(dá)到控制血糖的效果［1-2］。目前測(cè)定人血漿中西格列汀濃度的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［3］、激光二極管熱解吸-串聯(lián)質(zhì)譜法［4］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC―MS/MS）［5］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［6-8］。既往文獻(xiàn)中采用LC-MS/MS法測(cè)定血漿中西格列汀濃度時(shí)，血漿樣品的前處理過程大多采用液液萃取的方法，處理過程繁瑣費(fèi)時(shí)，并且大量的有機(jī)溶劑會(huì)造成環(huán)境污染。本課題組在血漿樣品的前處理過程中首次使用高通量96孔CleanertPPT沉淀板，操作簡(jiǎn)單快速，僅需要?dú)庠?，可在惰性氣體（氮?dú)猓┉h(huán)境下完成，減少了離心等操作，用時(shí)較短，重現(xiàn)性好?；诖耍疚陌凑?015年版中國(guó)藥典中的《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》建立了一種簡(jiǎn)單可靠、快速、準(zhǔn)確、敏感度高的LC-MS/MS分析方法，用于定量分析人血漿中西格列汀的濃度，為西格列汀在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 磷酸西格列汀標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，批號(hào)15-SCC-61-1）、磷酸西格列汀-d4標(biāo)準(zhǔn)品（化學(xué)純度97.11%，同位素純度99.8%，批號(hào)12-SHG-101-1）均購(gòu)于Toronto Research Chemicals；甲醇、乙腈(色譜級(jí)）購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；甲酸銨（分析純，批號(hào)20150731）購(gòu)于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無(wú)水甲酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20150515）購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；去離子水由實(shí)驗(yàn)室自制。磷酸西格列汀片（捷諾維，規(guī)格：100 mg/片）由Merck Sharp Dohme生產(chǎn)。8名健康成年志愿者由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院招募。志愿者在給藥前采集的血漿為空腹空白血漿，從8名受試者的空腹空白血漿中任取其中6個(gè)，即為6個(gè)不同來(lái)源人空腹空白血漿。

1.2 儀器 Prominence20A液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配備LC-20AD型輸液泵，DGU-20A3型脫氣機(jī)，CTO-20A型柱溫箱，SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器；Sciex TRIPLE QUADTM4000 Q-TRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司），配有ESI離子源及Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理軟件；XS105型分析天平（瑞士METTER TOLEDO公司）；TARGINTMVX-II型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；MULTI SPE-M96型固相萃取裝置（天津博納艾杰爾科技有限公司）；BM-40型純水制備系統(tǒng)（北京中盛茂源科技發(fā)展有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取適量磷酸西格列汀標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度分別為0.01、0.02、0.1、0.4、2、16、20 mg/L）和質(zhì)控工作液（濃度分別為0.03、1.5、5、15 mg/L）。精密稱取適量磷酸西格列汀-d4標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋得200 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 人血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線以及質(zhì)控樣品的配制 精密吸取人的空白血漿475 μL，加入25 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液或質(zhì)控工作液，得到濃度范圍為0.5～1 000 μg/L的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，以及濃度為1.5、75、250、750 μg/L的血漿質(zhì)控樣品。

1.5 生物樣品處理方法 向CleanertPPT沉淀板內(nèi)加入300 μL甲醇，100 μL內(nèi)標(biāo)工作液，100 μL含藥血漿后，渦旋 5 min，靜置5 min，加氮?dú)庹龎簩⑷芤簤哼^沉淀板，收集下清液至收集板中，進(jìn)樣5 μL，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

1.6 色譜條件 譜柱為Diamonsil C18柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為40℃。流動(dòng)相中的有機(jī)相（A）為甲醇、水相（B）為10 mmol/L甲酸銨水溶液（含10%甲醇，0.1%甲酸）。梯度洗脫：0～0.5 min 60%B，0.5～2.0 min 60%B→20%B，2.1～4.5 min 20%B，4.5～4.6 min 20%B→60%B，4.6～7.0 min 60%B；色流速為0.5 mL/min，儀器運(yùn)行時(shí)間為7 min，進(jìn)樣5 μL。

1.7 質(zhì)譜條件 采用ESI電噴霧離子化源，多反應(yīng)（MRM）正離子檢測(cè)模式進(jìn)行定量檢測(cè)；檢測(cè)參數(shù)：卷簾氣20 psi（1 psi=6.9 kpa），碰撞氣10 psi，噴霧電壓3 000 V，源溫度500 ℃，碰撞出口電壓15 V。

1.8 方法學(xué)驗(yàn)證 本研究嚴(yán)格按照2015年版中國(guó)藥典《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中的相關(guān)規(guī)定，對(duì)建立的LC-MS/MS方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，評(píng)價(jià)該方法的可行性。

1.8.1 選擇性 隨機(jī)取6個(gè)健康志愿者的空腹血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液（改加同等體積的甲醇）外，其余按1.5中步驟進(jìn)行LC-MS/MS分析。通過比較人空白血漿樣品、定量下限（LLOQ）的血漿樣品（以血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)0.5 μg/L作為定量下限）、人口服西格列汀片后的血漿樣品，考察該方法的特異性。

1.8.2 進(jìn)樣殘留情況 為考察進(jìn)樣殘留情況，按曲線最高濃度、空白人血漿樣品的順序進(jìn)樣分析，考察殘留情況。

1.8.3 線性范圍與定量下限 配制并處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，以待測(cè)物濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值 為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為=aX+b。按照1.5中步驟配制并處理LLOQ樣品（濃度為0.5 μg/L），進(jìn)行LC-MS/MS分析，考察3個(gè)分析批，每批6個(gè)樣本，計(jì)算批內(nèi)和批間的精密度以及準(zhǔn)確度。

1.8.4 準(zhǔn)確度與精密度 按照1.5中步驟配制并處理濃度為1.5、75、250、750 μg/L質(zhì)控樣品，進(jìn)行LC-MS/MS分析。連續(xù)考察3個(gè)分析批，每批、每個(gè)濃度6個(gè)樣本。應(yīng)用當(dāng)批標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各質(zhì)控樣品的濃度，考察分析方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.8.5 基質(zhì)效應(yīng)和回收率 配制濃度為1.5、75、250、750 μg/L的質(zhì)控血漿樣品，每一濃度平行測(cè)定6個(gè)樣本，得峰面積A。人空白血漿樣品按1.5中步驟取下清液并經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，用相?yīng)濃度溶液樣品復(fù)溶，每一濃度平行測(cè)定6個(gè)樣本，得峰面積B；濃度為1.5、75、250、750 μg/L溶液樣品進(jìn)樣得峰面積C，每一濃度平行測(cè)定6個(gè)樣本。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)和回收率，西格列汀回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%；同法計(jì)算內(nèi)標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)。

1.8.6 穩(wěn)定性 配制濃度為1.5、750 μg/L的血漿樣品，分別考察室溫放置4 h、-20℃凍存55 d、-20℃室溫3次凍融循環(huán)、處理后自動(dòng)進(jìn)樣器6℃放置48 h的穩(wěn)定性，按1.5中步驟操作，各濃度水平均為6個(gè)樣本。配制濃度為1.5、750 μg/L的含藥全血，分別于0 h、室溫放置1 h后離心，取血漿按1.5中步驟操作，考察西格列汀在全血中的穩(wěn)定性，各濃度水平均為6個(gè)樣本。

1.8.7 臨床藥代動(dòng)力學(xué)樣品檢測(cè) 8名健康成年志愿者進(jìn)行單次口服磷酸西格列汀片的藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，受試者于給藥日早上空腹（禁食10 h）口服捷諾維100 mg。分別于給藥前和給藥后20、40 min，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12、16、24、36、48、72 h采集血樣至肝素鋰抗凝管中，在4 ℃，3 000 r/min條件下離心10 min，分離血漿，保存于-20℃，運(yùn)送到本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析 在二級(jí)掃描模式下，西格列汀及內(nèi)標(biāo)西格列汀-d4生成的主要產(chǎn)物離子分別為m/z235.2和m/z239.0，質(zhì)譜圖見圖1。

Fig.1 The chemical structures and product ion mass spectrum of the［M+H］+ions of sitagliptin（A）,sitagliptin-d4(B)(internal standard)圖1 西格列汀和內(nèi)標(biāo)西格列汀-d4的化學(xué)結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜掃描圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性 空白血漿樣品的色譜圖見圖2A，LLOQ樣品的代表性色譜圖見圖2B，人空腹口服給藥8 h后樣品的代表性色譜圖見圖2C。西格列汀和內(nèi)標(biāo)西格列汀-d4的色譜保留時(shí)間分別為3.67 min和3.66 min。結(jié)果表明干擾組分的響應(yīng)低于該批次LLOQ待測(cè)物響應(yīng)的20%及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，表明人血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的定量分析。

Fig.2 Representative MRM chromatograms of sitagliptin and sitagliptin-d4 in human plasma圖2 西格列汀和西格列汀-d4的典型色譜圖

2.2.2 進(jìn)樣殘留情況 為考察進(jìn)樣殘留情況，曲線最高濃度進(jìn)樣后，分析空白人血漿樣品。結(jié)果顯示，空白人血漿中干擾組分的響應(yīng)低于當(dāng)批次LLOQ待測(cè)物響應(yīng)的1/5，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的1/20，不影響人血漿中西格列汀濃度的定量分析。

2.2.3 線性范圍和定量下限 線性范圍為0.5～1 000 μg/L的典型回歸方程為=0.008 09X+0.000 527，R2=0.998 6。結(jié)果表明西格列汀在0.5～1 000 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LLOQ樣品的代表性色譜圖見圖2B，相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。在LLOQ濃度下，西格列汀色譜峰的信噪比（S/N）＞10，準(zhǔn)確度為108%，批內(nèi)精密度為3.42%～8.22%，批間精密度為12.8%，表明本方法測(cè)定人血漿中西格列汀濃度的LLOQ可以達(dá)到0.5 μg/L。

Tab.1 Analysis of precision and accuracy for the sitagliptin in hum an plasma表1 西格列汀在人血漿中的精密度和準(zhǔn)確度分析（n=18，±s）

Tab.1 Analysis of precision and accuracy for the sitagliptin in hum an plasma表1 西格列汀在人血漿中的精密度和準(zhǔn)確度分析（n=18，±s）

濃度（μg/L）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控濃度0.5 1.5 75 250 750實(shí)測(cè)值0.54±0.04 1.64±0.05 82.30±2.64 247.00±9.70 765.00±18.50精密度（%）批內(nèi)3.42～8.22 2.01～4.16 1.20～3.33 0.83～5.93 0.84～3.46批間12.80 2.12 6.78 5.90 2.69準(zhǔn)確度（%）108 109 110 99 102

2.2.4 準(zhǔn)確度與精密度 西格列汀各濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度平均在99.0%～110%之間，批內(nèi)精密度為0.83%～5.93%，批間精密度為2.12%～6.78%，均符合有關(guān)生物樣品分析方法驗(yàn)證的要求，見表1。

2.2.5 基質(zhì)效應(yīng)和回收率 對(duì)于6個(gè)受試者的空腹血漿樣本，西格列汀在1.5、75、250、750 μg/L 4個(gè)濃度上的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)為99.2%、99.9%、99.7%、99.7%，基質(zhì)效應(yīng)的精密度小于1.80%，說明基質(zhì)效應(yīng)不會(huì)對(duì)樣品的分析產(chǎn)生影響。西格列汀在1.5、75、250、750 μg/L 4個(gè)質(zhì)控濃度上的回收率在89.3%～104.0%之間；內(nèi)標(biāo)的平均回收率為96.4%，結(jié)果說明回收率較高，不會(huì)對(duì)樣品的分析產(chǎn)生影響。

2.2.6 穩(wěn)定性 西格列汀的含藥血漿在不同貯存條件下穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度在93.8%～110%之間，見表2。含藥全血的穩(wěn)定性結(jié)果見表3，表明含藥全血室溫放置1 h穩(wěn)定。

Tab.2 Stability of sitagliptin in hum an plasma表2 西格列汀在人血漿中的穩(wěn)定性 （n=6，±s）

儲(chǔ)存條件 濃度（μg/L）室溫放置4 h三次凍融循環(huán)-20℃放置55 d自動(dòng)進(jìn)樣器放置48 h標(biāo)準(zhǔn)濃度1.5 750 1.5 750 1.5 750 1.5 750實(shí)測(cè)值1.60±0.07 772.00±6.08 1.57±0.10 704.00±37.40 1.64±0.051 784.00±4.55 1.62±0.052 766.00±7.78精密度（%）4.29 0.79 6.54 5.31 3.06 0.58 3.18 1.02準(zhǔn)確度（%）107 103 104 93.8 110 105 108 102

2.2.7 人體藥代動(dòng)力學(xué)研究 采用WinNonlin 7.0軟件，非房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，8例健康成年受試者單次口服100 mg磷酸西格列汀片后，西格列汀的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。

Fig.3 Mean plasma concentration of sitagliptin over time after oral administration of sitagliptin tablet 100 mg in 8 healthy adult volunteers圖3 8例健康成年志愿者單次口服西格列汀片100 mg平均血藥濃度-時(shí)間曲線

Tab.4 The pharmacokinetic parameters after oral adm inistration of sitagliptin(100 mg/tablet)表4 單劑量口服西格列汀片100 mg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=8，±s）

Tab.4 The pharmacokinetic parameters after oral adm inistration of sitagliptin(100 mg/tablet)表4 單劑量口服西格列汀片100 mg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=8，±s）

Cmax：達(dá)峰濃度；Tmax：達(dá)峰時(shí)間；AUC：生物利用度；MRT：平均滯留時(shí)間；Vd：表觀分布容積；CL：清除率；T1/2：半衰期

指標(biāo)C max（μg/L）T max（h）AUC0-72h（h·μg/L）AUC0-∞（h·μg/L）MRT0-72 h（h）藥動(dòng)學(xué)參數(shù)375±138 2.44±1.29 2 915±585 2 936±587 9.72±1.19指標(biāo)MRT0-∞（h）Vd（L）CL（L/h）T1/2（h）藥動(dòng)學(xué)參數(shù)10.20±1.34 563±160 35.10±5.77 11.10±2.41

3 討論

隨著人們熱量攝入的增加和體力活動(dòng)的減少，世界范圍內(nèi)糖尿病的患病率正在逐年增加，成為發(fā)病率最高的慢性病之一。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟的相關(guān)報(bào)告，2011年全球糖尿病患者已達(dá)到3.66億，2030年預(yù)計(jì)將達(dá)到5.52億，患病率約7.7%。糖尿病根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同可分為1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病是代謝紊亂導(dǎo)致的一種復(fù)雜疾病，是生活環(huán)境與遺傳因素的相互作用導(dǎo)致的胰島素抵抗［9］。

西格列汀是一種口服的強(qiáng)效選擇性DPP-Ⅳ抑制劑，與運(yùn)動(dòng)、飲食相結(jié)合用于治療2型糖尿病。相比于磺酰脲類等傳統(tǒng)降糖藥，降低了患者發(fā)生低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，并且該藥對(duì)控制患者的體質(zhì)量與血壓也有裨益［10-13］。

為了建立一種簡(jiǎn)便、選擇性好、敏感度高的LCMS/MS方法，本研究對(duì)質(zhì)譜、色譜及樣品處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。選擇了響應(yīng)高、特異性強(qiáng)的正離子掃描、多反應(yīng)檢測(cè)模式，進(jìn)一步優(yōu)化了分子離子、碎片離子及各項(xiàng)質(zhì)譜條件；由西格列汀結(jié)構(gòu)可知其極性相對(duì)較弱，因此在C18的反相色譜柱上有保留。Suresh等［14］也多采用C18柱，本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)考察了DiamonsilC18、 ZORBAX Eclipse XDB - C18、SymmetryC18、等不同色譜柱，發(fā)現(xiàn)保留順序是DiamonsilC18＞SymmetryC18＞ZORBAX Eclipse XDBC18，分析物在DiamonsilC18柱上有較好保留，因此被選中并進(jìn)一步優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)洗脫方式進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)開始采用等度洗脫（有機(jī)相/水相為80∶20），出峰較早，峰形較寬并且拖尾，隨后改為梯度洗脫（0～0.5 min 60%B，0.5～2.0 min 60%B→20%B，2.1～4.5 min 20%B，4.5～4.6 min 20%B→60%B，4.6～7 min 60%B）；開始采用高比例水相，可使其出峰延后，中間增大有機(jī)相比例，增強(qiáng)其洗脫能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間延后并且拖尾改善峰形變好。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定人血漿中西格列汀濃度LC-MS/MS方法中大多采用了液液萃取的方法，耗時(shí)費(fèi)力［6-8］。本研究在考察血漿樣品處理方法時(shí)，開始選擇了簡(jiǎn)單的沉淀蛋白，但直接沉淀的方法存在一定的基質(zhì)效應(yīng)和內(nèi)源性干擾；進(jìn)一步考慮采用CleanertPPT沉淀板，處理過程中有機(jī)溶劑沉淀的蛋白吸附于沉淀板內(nèi)，沉淀干凈完全，適用于高黏度血液樣品，并且基質(zhì)效應(yīng)影響低、回收率高。在內(nèi)標(biāo)的選擇上，選擇了待測(cè)物的穩(wěn)定同位素標(biāo)志物為內(nèi)標(biāo)，其色譜保留行為、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)、回收率以及質(zhì)譜條件等與待測(cè)物一致。

查閱文獻(xiàn)［15-20］發(fā)現(xiàn)，健康志愿者口服100 mg西格列汀片后，達(dá)峰濃度在200～500 μg/L之間，本研究設(shè)定的線性范圍為0.5～1 000 μg/L，既能滿足實(shí)際測(cè)樣的高濃度需求，又避免了對(duì)樣品再進(jìn)行稀釋處理；所有受試人體的AUC0-t/AUC0-∞的比例均大于80%，也滿足實(shí)際測(cè)樣的低濃度需求，保證能夠?qū)嵤┩暾娜梭w生物樣本濃度研究。

中國(guó)藥典2015年版《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》和EMEA 2011版藥品評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中對(duì)分析方法驗(yàn)證的要求基本一致，故本文建立的分析方法嚴(yán)格遵守2015年版藥典中規(guī)定的《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，并對(duì)該方法的選擇性、殘留、線性、準(zhǔn)確度、精密度、敏感度、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)等項(xiàng)目進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，可滿足藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的技術(shù)要求。此外，本分析方法可靠，能夠準(zhǔn)確測(cè)定人血漿中西格列汀的濃度，評(píng)價(jià)西格列汀在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，可用于支持該藥物仿制藥的生物等效性評(píng)價(jià)。