脂筏蛋白質組學分析揭示快速老化因素對SAMP8小鼠海馬組織的關鍵影響

張雪竹，付于，賈玉潔，韓景獻，聶坤

阿爾茲海默?。ˋD）是一種常見的神經退行性疾病，其發(fā)病機制一直是困擾醫(yī)學界的主要問題之一，其病理表現主要是神經元內神經纖維纏結形成和神經元外的老年斑，臨床表現多為伴隨衰老出現明顯的記憶障礙、失語、認知能力下降等［1］。近年來有關AD的研究不斷深入，但其發(fā)病機制復雜，迄今為止無論是其生物學機制還是臨床療法如淀粉樣蛋白疫苗均未取得關鍵性的突破［2］。已知衰老是AD最主要的危險因素，然而衰老因素如何在分子和細胞水平引起神經元功能障礙，相關機制并未得到充分闡明。

SAMP8小鼠作為典型的快速老化、癡呆小鼠，是常用的AD動物模型。相對于正常老化的SAMR1小鼠，SAMP8小鼠在進入成年期時迅速出現顯著的老化特征，在形態(tài)上出現明顯衰老態(tài)，病理上表現以腦干為中心出現海綿狀變化，同時出現典型的認知障礙，因而成為研究腦老化和癡呆關系的理想動物模型［3］。本研究以SAMP8小鼠為模型，利用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）定性蛋白質組學方法，檢測小鼠老化過程中海馬組織脂筏募集的蛋白質種類的變化，在細胞生物學層面揭示海馬組織在老化過程中的關鍵變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SAMP8小鼠和SAMR1小鼠，均由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SAM鼠繁育中心提供［許可證號SXCK（津）2015-0003］。SAMP8和SAMR1小鼠飼養(yǎng)在完全相同條件下，自由取食飲水。本研究經天津中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 Ficoll分離液和線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購于Sigma公司，蛋白酶抑制劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 抓鬮法隨機選取2月齡和8月齡SAMP8小鼠各40只，雌雄各半，分別定義為SAMP8幼年組、SAMP8老年組；另外抓鬮法隨機選取同月齡SAMR1小鼠各40只，設為正常老化對照，分別定義為SAMR1幼年組、SAMR1老年組。

1.2.2 提取小鼠海馬組織脂筏 脂筏提取采用蔗糖密度梯度超速離心法［4］：小鼠頸椎脫臼處死，剝取完整海馬組織，投入事先加入預冷脂筏提取液的玻璃勻漿器中充分勻漿，脂筏提取液的體積按質量/體積比（m/V）400 g/L計算，并加入5 mL的蛋白酶抑制劑。勻漿液先在EP管中靜置90 min（4℃），再以1 000×g離心15 min。上清液置于40%蔗糖中超速離心，離心管由下至上蔗糖密度梯度依次為40%、30%和5%，蔗糖離心參數：Hitachi Himac CP80WX，轉頭P80AT，4℃，200 000×g離心20 h。超速離心完成后，5%蔗糖與30%蔗糖分界處的乳黃色脂質物質即為脂筏，用注射器取出后置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 高效液相色譜-串聯質譜法蛋白質分析（HPLC-MS/MS 1D-LTQ） 脂筏樣品的酶解和肽鏈純化以及后續(xù)的質譜分析和蛋白質鑒定均由上海中科新生命生物科技有限公司提供技術服務。每組樣品按照預實驗方法各進行3次重復實驗。大致步驟如下：HPLC-MS/MS數據，采用shotgun analysis蛋白質鑒定，選用Swissport數據庫，物種選小鼠，設定好篩選參數，利用Bioworks Bioworks 3.1 software（Thermo）軟件中的Turbo SEQUEST程序，將MS/MS蛋白表達譜自動在小鼠數據庫（IPI MOUSE v3.29）進行檢索，合并輸出每組樣品蛋白鑒定列表。

1.2.4 生物信息學分析 鑒定出的蛋白質的生物信息學注釋和KEGG分析均采用DAVID生物信息學在線分析工具完成（https://david.ncifcrf.gov/geneReport.jsp），具體操作見網站指南。脂筏蛋白組的細胞定位分析，采用DAVID網站的GO注釋工具；脂筏蛋白組的代謝網絡分析，勾選KEGG選項。

1.2.5 小鼠Morris水迷宮動物行為學分析 Morris水迷宮隱蔽平臺測試具體方法見文獻［5］。整個測試為期5 d，方法簡述如下：每次測試時，先將小鼠輕輕放入水中，面朝池壁，再打開行為學軟件，記錄小鼠的游泳路線，統計小鼠從入水到找到平臺的長度和時間（逃避潛伏期，escape latency）；待小鼠在平臺上休息20 s后再次測試。如果小鼠120 s內沒找到平臺，潛伏期成績記為120 s。每天在2個入水點各測試1次，以2次潛伏期的算術均值作為這一天的成績，進行統計分析。

1.2.6 海馬組織線粒體提取 采用Clark方法［6］，在0～4℃環(huán)境下進行。完整海馬組織用分離介質洗去表面血跡后，置于預冷的玻璃勻漿器中，加入2 mL預冷的分離介質液（0.025 mmol/L蔗糖，0.075 mol/L甘露醇，1 mmol/L EGTA），手動充分勻漿。勻漿液離心3 min（4℃，2 000×g），取上清液再次離心8 min（4℃，12 500×g）。棄上清，沉淀加入3%的Ficoll液5 mL（3%Ficoll，0.12 mol/L蔗糖，0.03 mol/L甘露醇，25 μmol/L EDTA-K，Tris調整pH=7.4）中懸浮，仔細分層入6%Ficoll液10 mL（6%Ficoll，0.12 mol/L蔗糖，0.03 mol/L甘露醇，25 μmol/L EDTA-K，Tris調整pH=7.4），10 400×g離心30 min，沉淀，用分離介質懸浮，12 100×g離心10 min，所得沉淀即為線粒體。稀釋后馬上用于線粒體功能檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測 使用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和流式細胞儀檢測線粒體膜電位。以BCA方法定量線粒體濃度，再把線粒體懸浮液調整到統一濃度，按照試劑盒說明，試管中加入JC-1熒光試劑及線粒體常溫孵育30 min，以流式細胞儀（BD）檢測紅色熒光和綠色熒光值，JC-1單體檢測設置激發(fā)光波長為490 nm，發(fā)射光為530 nm；JC-1聚合物檢測設置激發(fā)光波長為525 nm，發(fā)射光為590 nm。對捕獲的紅色和綠色熒光信號進行分析，紅、綠熒光值的比值代表膜電位的高低。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行數據統計分析，符合正態(tài)分布的變量以均數±標準差（±s）表示，Morris水迷宮數據組間均數比較采用具有一個重復測量的雙因素方差分析（Two-way ANOVA），線粒體膜電位數據組間均數比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

Fig.1 Results of performance of the aged SAMP8 and the control SAMR1 mice during the five training days of a hidden platform圖1 SAMP8老年組和SAMR1老年組小鼠在5 d的隱藏平臺成績測試中的表現

2.1 Morris水迷宮動物行為學檢測 圖1顯示了在5 d訓練期內各老年組小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期的學習成績曲線。在Morris水迷宮測試中，SAMP8老年組和SAMR1老年組小鼠在5 d的訓練中逃避潛伏期均顯著縮短，小鼠品系之間的逃避潛伏期成績差異有統計學意義（F品系=9.283，P＜0.01）。成年SAMR1小鼠的逃避潛伏期在5 d的訓練中一直在減少，但SAMP8小鼠僅在最初3 d內發(fā)現隱藏平臺在減少，最后2 d不再減少，這與SAMR1小鼠明顯不同，提示SAMP8老年組小鼠出現明顯的學習記憶障礙。

2.2 海馬組織中脂筏蛋白質組的鑒定和注釋 采用定性分析的shotgun蛋白質組學技術，鑒定出各組脂筏樣本的蛋白質種類。對蛋白質組進行注釋，發(fā)現最大的功能群體是線粒體蛋白質，提示線粒體對神經元的功能非常關鍵。結果顯示，SAMP8和SAMR1小鼠海馬組織脂筏募集的蛋白質種類和數目均隨月齡增加而減少，提示老化因素引發(fā)海馬組織細胞生命活動的明顯衰退，見表1。

2.3 老年組SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質組的GO富集分析 以幼年組小鼠的脂筏蛋白質組為背景，對老年組小鼠的海馬組織脂筏蛋白質組的富集分析，結果見表2。正常老化的SAMR1小鼠海馬組織脂筏蛋白質組細胞定位富集度前10的詞條中，排在前4的均是線粒體相關詞條，其中，線粒體排在第2位，提示老化過程中線粒體功能在神經元細胞功能中的關鍵作用。

Tab.2 Top 10 term s that aging factors affect the enrichment of lipid rafting proteome in hippocampus表2 老化因素影響海馬組織脂筏蛋白質組細胞定位的富集度排名前10詞條

快速老化的SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質組細胞定位富集度前10的詞條中，排在前3的均是線粒體相關詞條。與正常老化對照組SAMR1比較，SAMP8有兩個明顯不同：線粒體從第2降到第6位；線粒體相關詞條的蛋白數目均大幅度減少。結果提示，老化過程中，對比SAMR1小鼠，SAMP8小鼠海馬神經元細胞功能中發(fā)生的關鍵性變化可能是線粒體功能的顯著衰退。

2.4 老年組SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質組的KEGG代謝網絡途徑分析 對小鼠海馬組織脂筏蛋白質組進行KEGG代謝網絡途徑分析，結果顯示，對照組SAMR1小鼠有統計學意義的關鍵KEGG代謝網絡途徑有4個，排在首位的是線粒體的氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）通路，其余3個均為神經退行性病變相關代謝途徑。與SAMR1不同，快速老化SAMP8小鼠有統計學意義的6項代謝途徑中，排在前2位的是亨廷頓病和AD代謝途徑，線粒體的氧化磷酸化代謝途徑排在第3位，該途徑的蛋白數目大幅度減少。結果提示，老化過程中對比對照組SAMR1小鼠，SAMP8小鼠海馬神經元線粒體氧化磷酸化代謝功能顯著衰退。見表3。

Tab.3 Analysis of KEGG pathway in hippocam pal lipid rafts during aging表3 老化因素對SAMP8海馬組織脂筏蛋白質影響的KEGG代謝通路分析

2.5 SAMP8小鼠海馬組織線粒體膜電位的檢測 如圖2示，SAMR1小鼠老化過程中線粒體膜電位顯著下降（92.77%±10.05%vs.84.52%±10.37%，t=3.350，P＜0.01），提示在老化過程中線粒體氧化磷酸化功能也顯著下降；SAMP8小鼠老化過程中線粒體膜電位也顯著下降（90.12%±12.93%vs.68.34%±11.42%，t=4.509，P=0.001）。與 SAMR1小鼠不同的是，SAMP8小鼠線粒體膜電位下降幅度遠遠超過SAMR1小鼠。線粒體膜電位的下降反映線粒體氧化磷酸化功能的衰退，結果提示，在老化過程中SAMP8小鼠海馬組織線粒體氧化磷酸化功能過度衰退。

Fig.2 Mitochondrial membrane potential in hippocampal tissues of SAMP8 mice during aging圖2 老化因素對SAMP8小鼠海馬組織線粒體膜電位的影響

3 討論

本研究以SAMP8小鼠為老年癡呆動物模型，以SAMR1小鼠為正常老化動物模型，分析了老化過程中SAMP8小鼠海馬組織的關鍵生物學變化。利用海馬組織脂筏蛋白質組的生物信息學分析，發(fā)現SAMP8小鼠海馬組織在老化過程中最關鍵的細胞變化是線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退，這可能是其癡呆發(fā)生的重要細胞學機制。

3.1 脂筏是膜蛋白募集平臺 研究顯示，脂筏在細胞跨膜信號傳導過程中起關鍵作用。隨著跨膜信號的活化，脂筏會募集大量相關功能蛋白到脂筏平臺，組裝成脂筏上的蛋白質功能復合體［7］。通過檢測脂筏募集的蛋白質種類能觀察到細胞活動的關鍵變化。本研究采用定性蛋白組學技術鑒定脂筏募集的蛋白質種類，試圖闡明老化過程中關鍵的細胞學變化。

3.2 線粒體氧化磷酸化功能 本研究顯示，正常老化的SAMR1小鼠中，海馬組織脂筏蛋白質組的GO分析和KEGG分析均顯示，線粒體功能相關蛋白被脂筏大量募集，提示線粒體功能的活化對維持老年小鼠神經元細胞功能有關鍵作用；而快速老化的SAMP8小鼠中，GO分析顯示，與對照小鼠比較，脂筏募集的線粒體相關蛋白大幅度減少，富集度大幅度降低，提示老化癡呆的SAMP8小鼠線粒體活動過度衰退。KEGG分析和線粒體膜電位檢測則進一步證實，線粒體的氧化磷酸化功能過度衰退是SAMP8小鼠快速老化進程海馬神經元細胞的關鍵變化。

3.3 SAMP8小鼠線粒體功能障礙 線粒體是真核生物細胞的能量工廠，通過電子傳遞鏈發(fā)生氧化磷酸化過程，為細胞合成大量三磷酸腺苷（ATP），在能量代謝中發(fā)揮關鍵作用。敏感藥物、細胞內理化變化以及凋亡相關的跨膜信號途徑的激活均會抑制線粒體功能，引起細胞內ATP合成減少，使細胞處于能量缺乏狀態(tài)。線粒體功能對各種類型的細胞應激反應是高度敏感的，細胞氧化應激、內質網應激也會引起線粒體分裂減少，降低線粒體數量，引發(fā)線粒體功能衰退。線粒體功能衰退對人類衰老起著推動作用，隨年齡增長，線粒體功能下降成為細胞衰老的標志［8-9］。線粒體功能異常在神經退行性疾病的發(fā)生和進展中起著關鍵作用，目前已知帕金森?。≒D），AD以及亨廷頓?。℉D）等衰老相關的神經退行性疾病均與線粒體功能障礙相關［10-11］。介導線粒體自噬過程的PINK1和Parkin信號通路障礙是PD的關鍵發(fā)病因素，該信號通路障礙會導致缺陷線粒體不能及時被消除，最終導致黑質多巴胺能神經元的進行性缺失，引發(fā)PD。本研究發(fā)現，老化的SAMP8小鼠海馬神經元線粒體的氧化磷酸化功能過度衰退，線粒體膜電位大幅度下降，提示AD海馬神經元的功能障礙與PD和HD的細胞機制相似，均是由神經元線粒體能量代謝過度衰退導致ATP的合成障礙引發(fā)的。

3.4 SAMP8小鼠線粒體氧化磷酸化功能與癡呆 線粒體對維持神經元的正常功能十分關鍵。人體中樞神經系統質量雖然占全身的比重很小，但耗氧量占的比重卻很大。在神經元中，線粒體產生的ATP，一部分用來保證神經元正常生命活動的需要，另一部分用于維持神經元的細胞電位，更重要的是，神經元的短途物質運輸和長途物質運輸均需要線粒體參與。在神經元突起中，線粒體以細胞骨架微管為導軌，依靠馬達蛋白的ATP酶提供動力，大量向突觸前膜區(qū)域遷移聚集，依靠細胞骨架蛋白的支撐，參與到神經遞質囊泡的轉運和分泌過程，維持神經元正常的神經遞質信號傳遞功能［13］。要滿足這種對能量的巨大需求，中樞神經神經元需要大量正常功能的線粒體。Morris水迷宮檢測顯示老化的SAMP8小鼠出現明顯學習記憶障礙，筆者推測隨著快速老化過程中線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退，細胞內ATP會減少，SAMP8小鼠海馬組織神經遞質的分泌和信號傳遞過程以及突觸功能均產生異常，使小鼠的學習記憶和認知功能均出現障礙，從而在行為學上出現明顯的癡呆表型。本研究結果提示，線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退可能是其癡呆發(fā)生的重要細胞學機制。