混合鹽堿脅迫下接種叢枝菌根真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響

劉 倩,高婭妮,柳 旭,周文楠,王佺珍

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,楊凌 712100

世界上約有10億hm2的土壤受到鹽漬的影響,嚴(yán)重抑制著作物的生長,尤其在干旱和半干旱地區(qū)仍呈不斷惡化的趨勢[1-2]。土壤鹽化與堿化常常同時發(fā)生,而很多研究將鹽堿脅迫籠統(tǒng)地稱為鹽脅迫,忽略了堿脅迫的存在[3]。實際上,堿性鹽除了鹽度外還伴隨著高pH,由NaHCO3和Na2CO3引發(fā)的堿性鹽要比由NaCl和Na2SO4引發(fā)的中性鹽對植物的傷害更大,是兩種不同的非生物脅迫[4-5]。近年來,隨著氣候變化和人類生產(chǎn)活動的影響,土壤鹽堿化日趨擴(kuò)大,嚴(yán)重威脅著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的建設(shè)。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生豆科牧草,具有一定的固氮和抗脅迫能力,是國際公認(rèn)的最優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)牧草,在世界上廣泛種植[6]。而在鹽堿地上其生長受阻,產(chǎn)量下降,限制了苜蓿的推廣與應(yīng)用。叢枝根菌真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)與植物根系可以形成互惠共生體,改善植物的礦質(zhì)營養(yǎng)及土壤的物理結(jié)構(gòu)[7]。根瘤菌可以與豆科植物共生固氮,提高苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)。而鹽脅迫會降低結(jié)瘤率和固氮酶活性,對植物固氮產(chǎn)生影響[8]。雙接種AMF和根瘤菌不僅可以促進(jìn)其營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,增強(qiáng)植物的抗逆性,還可以使苜蓿結(jié)瘤固氮,促進(jìn)其生長[9]。同時,這種雙接種方法在生化和生理上提高抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)能力來提高植物的抗鹽性[8]。與單獨接種根瘤菌相比,鹽脅迫下同時接種兩種根際促生菌更能提高甘草產(chǎn)量及其莖和根中的氮含量[10]。

正交試驗設(shè)計是利用正交表安排部分多因素實驗來代替全面實驗。不僅可以確定影響因素的主次效應(yīng)順序,還可以研究因素間的交互效應(yīng),找出優(yōu)化條件或?qū)嶒炞顑?yōu)組合[11]。目前有很多關(guān)于鹽脅迫下植物接種AMF或/和根瘤菌的研究及混合鹽堿脅迫下植物單獨接種AMF或根瘤菌的研究,而混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿同時接種AMF和根瘤菌的研究卻鮮有報道。因此,本研究采用正交設(shè)計的方法,避免了常規(guī)實驗設(shè)計規(guī)模大、限制因素多、操作繁瑣、效率低等缺點[11]。探討了苜蓿可以耐受的鹽堿濃度以及AMF和根瘤菌混合接種對鹽堿脅迫下紫花苜蓿生長及生理的影響。該結(jié)果以期將為緩解鹽堿地對苜蓿生長的傷害,為提高苜?？果}堿性及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐提供決策參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 寄主植物

紫花苜蓿(金皇后,MedicagosativaL. ‘Jinhuanghou’)種子由酒泉大業(yè)種業(yè)有限公司提供。苜蓿種子經(jīng)10% H2O2浸泡10 min滅菌,再用70%的乙醇滅菌3分鐘,用無菌蒸餾水沖洗干凈后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿(680 mm×315 mm×170 mm)中。在人工氣候培養(yǎng)箱(光25℃/暗25℃ 各12 h,70%濕度)中萌發(fā),每天用無菌蒸餾水補(bǔ)充水分,待幼苗長出兩片子葉時,將其移到花盆中。

1.1.2 供試菌種

叢枝菌根真菌摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)購自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所,接種物為內(nèi)含摩西球囊霉孢子、侵染根段及根外菌絲的沙土混合物；根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)由西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗室提供,接種物為由液體菌種搖菌后得到的液體菌劑。

1.2 實驗設(shè)計

根據(jù)中國東北地區(qū)鹽堿土的特點,實驗將兩種中性鹽(NaCl、Na2SO4)和兩種堿性鹽(Na2CO3、NaHCO3)按照一定的比例和濃度模擬出4種鹽濃度(25,75,100,150 mmol/L,鹽脅迫)、16種pH(7.67—10.52,堿脅迫)梯度[4](表1)。

表1 各處理液的鹽分組成、鹽濃度、摩爾比及pH值

SAS: 鹽堿脅迫 Saline-alkaline stress

實驗采用混合正交設(shè)計表L16(161×22)。鹽堿脅迫(因素X2)包括4個水平(25、75、100、150 mmol/L)；pH(因素X1)包括16個水平；根瘤菌(因素X3)包括兩個水平(接種和不接種)；摩西管柄囊霉(因素X4)包括兩個水平(接種和不接種)。共有32個處理,每個處理重復(fù)3次。以沒有鹽堿和菌劑處理為對照組,設(shè)4個對照也是3次重復(fù),共計108個花盆。

1.3 盆栽實驗

每個花盆裝3 kg用15%工業(yè)NaClO消毒過的石英砂(粗砂20—40目∶細(xì)沙40—70目=1∶3,m:m)。挑選長出三片子葉且生長整齊一致的紫花苜蓿幼苗移栽于混有摩西管柄囊霉接種物的石英砂中(層播,5 g/盆)。根瘤菌菌劑采用根灌法接種,用注射器把配制好的菌懸液注射在幼苗根部(10 mL/株)。在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)系全自動日光溫室進(jìn)行花盆實驗,隔一天澆一次營養(yǎng)液,65 d后進(jìn)行鹽堿脅迫處理,隔1 d澆1次鹽堿混合液,脅迫處理14 d后分別收獲苜蓿地上地下部分。收獲當(dāng)天,每個花盆中選取3株苜蓿用鑷子取下其根瘤,統(tǒng)計根瘤數(shù)及根瘤重,檢測AM真菌侵染狀況。然后將樣品放入-80℃超低溫冰箱中保存以進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測定。

1.4 測定項目及方法

株高用刻度尺準(zhǔn)確度量,精確至mm；地上干重用電子天平稱量(0.01 g)；POD活性測定參考Zhang等[12]的方法,用愈創(chuàng)木酚法顯色法測定；SOD活性的測定參考Beyer和Fridovich[13]的方法；丙二醛(MDA)和脯氨酸(proline)參照Madhava和Sresty[14]的方法,分別采用硫代巴比妥酸法測定和茚三酮法測定；可溶性蛋白含量測定參照Bradford[15]的方法；采用計數(shù)法統(tǒng)計根瘤菌數(shù)；用電子天平稱量根瘤菌干重,采用根段法鏡檢[16]AM菌根侵染狀況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及正交分析,采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行各處理組間差異顯著性分析,測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。將根瘤菌、AMF及pH作為自變量Xi,各項指標(biāo)作為因變量Yi,固定離散變量根瘤菌,采用SAS(V20.0)建立因變量Yi與自變量Xi的二元三次回歸模型[17-18],其關(guān)系方程如下：

式中,β是常量。

2 結(jié)果分析

2.1 AMF和根瘤菌對鹽堿脅迫下紫花苜蓿株高及莖高凈增長量的影響

除鹽堿類型外,pH、根瘤菌、AMF以及4個因素間兩兩交互作用都對紫花苜蓿株高有顯著影響(表2)。與對照相比,正交處理組第3、6、23、28、29組中紫花苜蓿株高都有一定程度的降低,而這幾組都未接種根瘤菌或摩西管柄囊霉,其他處理組中紫花苜蓿株高都大于對照。第7組(B鹽100 mmol/L,pH 8.56,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉)處理組株高最高,第23組(B鹽100 mmol/L,pH 8.56,不接種根瘤菌或摩西管柄囊霉)處理組株高最低(表3)。第7組和第19組差異不顯著,與其他處理組差異顯著,第23組和第1、7、13、19組差異顯著,與其他處理組差異都不顯著。處理中四類鹽對應(yīng)的株高順序依次是D>C>B>A(表3)。在整個植物生長過程中,沒有植株死亡,但隨著脅迫時間的延長,D鹽脅迫下的處理組出現(xiàn)葉片萎焉失綠,甚至凋落現(xiàn)象,其他處理組長勢較好。而莖高凈增長量分別在第1組(A鹽25 mmol/L,pH 7.67,接種摩西管柄囊霉)和第6組(B鹽75 mmol/L,pH 8.21,不接種根瘤菌或摩西管柄囊霉)出現(xiàn)最大值和最小值,但這兩組差異不顯著。由極差R值及正交實驗結(jié)果得出(表3),不同因素對紫花苜蓿株高的影響程度依次是AMF+根瘤菌>pH>AMF>鹽堿類型>根瘤菌,對莖高的凈增長量影響程度依次是pH>鹽堿類型>AMF+根瘤菌>AMF>根瘤菌(表4、表5)。該結(jié)果表明,pH對紫花苜蓿的抑制生長作用大于鹽脅迫,同時接種摩西管柄囊霉和根瘤菌對紫花苜蓿的促進(jìn)生長作用大于單獨接種摩西管柄囊霉或根瘤菌,而單獨接種摩西管柄囊霉的作用又大于單獨接種根瘤菌的作用。

表2 鹽堿類型、pH、根瘤菌及AMF對紫花苜蓿株高、地下生物量及地上生物量影響的方差分析

X1: pH；X2: 鹽堿類型,Saline-alkaline stress；X3：根瘤菌,rhizobia；X4：AMF；ns: 無顯著影響 No significant difference

表3 株高的正交試驗結(jié)果

Table 3 Shoot length of alfalfa in orthogonal matrix experiment

處理TreatmentpH(X1)鹽堿(X2)SAS/(mmol/L)根瘤菌(X3)RhizobiaAMF(X4)AMF+根瘤菌(X5)株高Shoot length/cm17.671(A鹽25)2(不接種)1(接種)13.05±2.49bcd27.922(A鹽75)1(接種)11(雙接種)12.05±1.47bcde37.973(A鹽100)22(不接種)2(不接種)9.63±0.46de48.064(A鹽150)1211.63±2.82cde58.115(B鹽25)1212.26±3.60bcde68.216(B鹽75)2229.51±0.72de78.567(B鹽100)11116.31±3.26a88.858(B鹽150)2111.68±0.87cde99.029(C鹽25)22210.35±1.68de109.7910(C鹽75)1210.97±2.34cde119.8711(C鹽100)2111.97±2.37bcde1210.1312(C鹽150)11112.38±2.32bcde1310.2613(D鹽25)11114.33±1.67abc1410.3814(D鹽75)2110.00±2.27de1510.4615(D鹽100)129.79±2.16de1610.5216(D鹽150)22210.04±0.76de177.6711212.14±1.84bcde187.92222211.87±1.56cde197.97311115.47±2.2ab208.0642112.43±0.47bcde218.1152112.27±0.989bcde228.21611111.73±0.64cde238.5672228.81±0.65e248.8581211.78±2.66cde259.02911111.96±1.68bcde269.79102111.96±1.73bcde279.87111210.36±1.47de2810.13122228.93±0.65e2910.26132229.36±0.49e3010.3814129.53±1.53de3110.46152110.69±0.71de3210.521611112.17±0.89bcdeCK7.002229.99±0.46deK112.5912.2812.1812.5313.30K211.9611.7910.7810.449.81K312.5511.11K412.0310.74K512.27K610.62K712.56K811.73K911.15K1011.47K1111.17K1210.66K1311.85K149.77K1510.24K1611.10

續(xù)表處理TreatmentpH(X1)鹽堿(X2)SAS/(mmol/L)根瘤菌(X3)RhizobiaAMF(X4)AMF+根瘤菌(X5)株高Shoot length/cmR2.821.541.42.093.49順序Order24531

CK: 對照處理 Control;R：正交極差值;K：4種因素各水平的均值；不同小寫字母表示不同處理間在95%置信水平下差異顯著

表4 鹽堿脅迫及根瘤菌、摩西球囊霉處理下紫花苜蓿生物量和莖高凈增長量的正交實驗結(jié)果

CK: 對照處理 Control; 不同小寫字母表示不同處理間在95%置信水平下差異顯著,圖中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

表5 各因素每個水平的平均值和極差

2.2 AMF和根瘤菌對鹽堿脅迫下紫花苜蓿生物量的影響

4種因素及其兩兩間的交互作用都對紫花苜蓿的地上生物量有顯著影響。pH、pH與根瘤菌的交互作用、鹽堿類型與根瘤菌的交互作用及鹽堿類型與AMF的交互作用對植株地下生物量影響顯著(表2)。正交處理組中紫花苜蓿地上及地下生物量的最小值都出現(xiàn)在第25組(C鹽25 mmol/L,pH 9.02,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉)即地上部與地下部生物量在相同條件下達(dá)到最小值。而地上、地下生物量分別在在第21組(B鹽25 mmol/L,pH 8.1,單接摩西管柄囊霉)、第13組(D鹽25 mmol/L,pH 10.26,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉)出現(xiàn)最大值。地上生物量中第21組與第2、7、11、12、13、19、20組差異不顯著,與其他處理組都差異顯著。地上生物量中第13組與第4、5、9、11、17—10組差異不顯著,與其他處理組都差異顯著(表4)。從正交處理結(jié)果和極差R來看(表4、表5),不同因素對紫花苜蓿地上、地下生物量的影響程度相似,順序依次是pH>鹽堿類型>AMF+根瘤菌≥AMF>根瘤菌,鹽堿類型對其的影響程度依次是D>C>B>A。該結(jié)果表明鹽堿引發(fā)的pH對紫花苜蓿生物量的影響要大于鹽堿類型,且大于AMF和根瘤菌的作用。

表6 鹽堿類型、pH、根瘤菌及AMF對紫花苜蓿SOD、MDA、蛋白質(zhì)、脯氨酸及POD影響的方差分析

2.3 AMF和根瘤菌對鹽堿脅迫下紫花苜蓿丙二醛(MDA)和脯氨酸含量的影響

鹽堿類型對紫花苜蓿脯氨酸含量有顯著影響,而其他因素及其交互作用對MDA和脯氨酸的影響都不顯著(表6)。不同的處理對紫花苜蓿中MDA和脯氨酸積累量影響不同。MDA在第15組(D鹽75 mmol/L,pH 10.46,單接摩西管柄囊霉)和第23組(B鹽100 mmol/L,pH 8.56,不接菌)分別出現(xiàn)最小值和最大值。脯氨酸在第24組(B鹽100 mmol/L,pH 8.85,單接根瘤菌)和29組(D鹽25 mmol/L,pH 10.26,不接菌)分別出現(xiàn)最大值和最小值。MDA在第15組除和第4組、第23組差異顯著外,與其他組差異都不顯著(表7)。由正交處理結(jié)果和極差R值得出(表7、表8),不同因素對紫花苜蓿MDA和脯氨酸含量影響程度相同,依次是pH>鹽堿類型>AMF+根瘤菌>AMF>根瘤菌。該結(jié)果表明,鹽堿脅迫是引發(fā)植物MDA和脯氨酸積累的主要因素,其影響要大于AMF和根瘤菌的作用。

2.4 AMF和根瘤菌對鹽堿脅迫下紫花苜蓿SOD和POD的影響

鹽堿類型、AMF、鹽堿類型與根瘤菌的交互作用及鹽堿類型與AMF的交互作用都對SOD有顯著影響。根瘤菌、鹽堿類型與根瘤菌的交互作用、鹽堿類型與AMF的交互作用及根瘤菌與AMF的交互作用對POD影響顯著(表6)。pH與不同處理對紫花苜蓿中SOD、POD活性的影響不同。SOD在第19組(A鹽100 mmol/L,pH 7.97,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉)和29組(D鹽25 mmol/L,pH 10.26,不接菌)分別出現(xiàn)最小值和最大值。POD在第7組(B鹽100 mmol/L,pH 8.56,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉)和第11組(C鹽100 mmol/L,pH 9.87,單接摩西管柄囊霉)分別出現(xiàn)最大值和最小值。SOD在第29組和第11組、第15組、第19組、第23組差異顯著(表7)。由正交處理結(jié)果和極差R值得出(表7、表8),不同因素對紫花苜蓿SOD的影響程度依次是pH>AMF+根瘤菌>鹽堿類型>AMF>根瘤菌,對POD的影響程度依次是pH>AMF+根瘤菌>根瘤菌>AMF>鹽堿類型。該結(jié)果表明鹽堿脅迫引發(fā)的pH是影響植物酶活性的主要因素,AMF+根瘤菌處理明顯提高SOD和POD活性。

2.5 AMF和根瘤菌對鹽堿脅迫下紫花苜蓿可溶性蛋白的影響

總體來看,可溶性蛋白含量在所有處理組中變化不大。鹽堿類型與兩種菌間的交互作用對可溶性蛋白影響顯著(表6)。在第11組(C鹽100 mmol/L,pH 9.87,單接摩西管柄囊霉)和30組(D鹽75 mmol/L,pH 10.38,單接根瘤菌)分別出現(xiàn)最大值和最小值。第11組與第26組(C鹽75 mmol/L,pH 9.87,單接根瘤菌)、30組差異顯著,與其他處理組差異都不顯著,而30組除與26組差異不顯著外,與其他處理組都差異顯著(表7)。由極差R(表7、8)得出,不同因素對紫花苜?？扇苄缘鞍缀康挠绊懗潭纫来问莗H>鹽堿類型>根瘤菌>AMF+根瘤菌=AMF。該結(jié)果表明鹽堿脅迫及其引發(fā)的高pH值對紫花苜蓿可溶性蛋白含量的影響強(qiáng)于根瘤菌和摩西管柄囊霉。

表7 鹽堿脅迫及根瘤菌、摩西球囊霉處理下紫花苜蓿丙二醛、脯氨酸、SOD、POD及可溶性蛋白含量的正交實驗結(jié)果

表8 各因素每個水平的平均值和極差

2.6 AMF及根瘤菌對紫花苜蓿根部的侵染狀況

在AMF接種處理的石英砂中菌根均有侵染紫花苜蓿根部,而未做AMF接種處理的石英砂中沒有檢測到AMF侵染苜蓿根部。接種了根瘤菌的紫花苜蓿,根部均結(jié)有灰褐色根瘤。在有單獨接種根瘤菌的處理中根瘤數(shù)是960個,重0.433 g, 雙接種處理中根瘤數(shù)是1162個,重0.452 g。雙接種處理中的根瘤數(shù)和根瘤重都略高于單獨接種根瘤菌的處理,但差異不顯著。

2.7 模型分析

通過正交結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),5種不同因素對紫花苜蓿地上生物量、地下生物量、莖高凈增長量、脯氨酸含量及MDA含量的影響程度相同,都為pH>鹽堿類型>AMF+根瘤菌>AMF>根瘤菌。根瘤菌的影響最小,因此,將根瘤菌固定,擬合出這3個指標(biāo)關(guān)于pH和AMF的二元三次回歸曲線。方差分析表明,模擬項的P<0.05,方差顯著,說明在實驗范圍內(nèi)模型與實際情況吻合。隨鹽堿脅迫程度加劇或pH的增大,地上生物量和MDA含量基本呈現(xiàn)出一個U型軌跡,而莖凈增長量卻呈現(xiàn)出一個倒U型的軌跡。與對照相比,單獨接種根瘤菌和同時接種AMF和根瘤菌的處理對紫花苜蓿地上部生物量都有顯著的促進(jìn)作用。而對于莖凈增長量這種促進(jìn)生長作用卻不明顯,鹽堿脅迫對其的抑制生長作用表現(xiàn)更明顯。這與正交分析結(jié)果一致。pH<9或在9附近時,保護(hù)酶系統(tǒng)在短期內(nèi)仍能維持活性氧產(chǎn)生及清除的動態(tài)平衡,莖生長速率雖然減緩但莖仍能保持生長,而pH超過這一臨界范圍,動態(tài)平衡被破壞,紫花苜蓿生長受到嚴(yán)重抑制(圖1)。表明接種根瘤菌和AMF可以提高紫花苜蓿耐鹽堿性,使其在pH 約為9 (C鹽,25—75 mmol/L)的土壤中仍能正常生長。

圖1 紫花苜蓿地上生物量、莖凈增長量、MDA含量隨pH的變化Fig.1 The variance of above biomass, shoot increment and MDA content with pH CK：對照組 Control；R：接種根瘤菌處理組 Rhizobium；AMF+R：雙接種AMF和根瘤菌處理組；MDA：丙二醛 Malonaldehyde

3 討論

混合鹽堿脅迫下接種根瘤菌與摩西管柄囊霉對紫花苜蓿的影響也可以通過其地上、地下的生物量來反映。地上與地下生物量的分配是紫花苜蓿適應(yīng)鹽堿的一種方式,當(dāng)苜蓿受到脅迫時,根瘤菌和摩西管柄囊霉就近保護(hù)的是植株根部,所以對地下生物量影響較小,而地上部光合作用減弱,生物量積累下降。在高濃度鹽堿脅迫下(pH 10.5—11),接種AMF和根瘤菌的苜蓿干重比對照要低,可能菌根化植物具有更高的水勢能,在鹽堿脅迫中增加了植物含水量。這與Feng等[24]研究結(jié)果一致。根瘤菌、摩西管柄囊霉與紫花苜蓿是互惠共生的,Kbdei-Lateif等[25]發(fā)現(xiàn)根瘤菌能促進(jìn)豆科植物根部類黃酮的排出,有利于AMF孢子萌發(fā)、菌絲分枝和次生孢子的形成。必要條件下,植物還可以把這些植物生長促生菌當(dāng)做營養(yǎng)物質(zhì)的來源[26]。本實驗研究結(jié)果表明,在高濃度鹽堿脅迫下,兩種菌不能完全抵消鹽堿對植物的抑制作用。植物細(xì)胞內(nèi)離子失衡,代謝紊亂,苜蓿營養(yǎng)不良停止生長,AMF和根瘤菌不能從苜蓿中獲得足夠的碳源,互惠作用受限[27]。

鹽堿抑制植物的生長主要有兩個階段,第一個階段主要是由高濃度的鹽引起的水分虧缺造成的[28]。隨著脅迫時間的延長,進(jìn)入第二個階段,離子毒害成為抑制植物生理代謝的主要因素[1]。鹽堿脅迫下紫花苜蓿最先受到傷害的是細(xì)胞膜,MDA是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可以反映細(xì)胞的受損程度。許多研究表明,隨著脅迫強(qiáng)度的增大,植物中MDA含量呈先升高后下降的趨勢[29-30]。而本研究結(jié)果正好與此相反,隨著鹽堿脅迫程度的加大,pH值升高,MDA含量一開始呈下降趨勢。其原因是AMF和根瘤菌提高了植物的抗逆性,使保護(hù)酶系統(tǒng)在短期內(nèi)仍能維持活性氧的動態(tài)平衡,后隨著鹽堿脅迫程度的加大,體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及清除的動態(tài)平衡受到破壞,MDA含量明顯回升。這與Li等[31]的結(jié)果一致。雙接種處理的紫花苜蓿中,大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、甜菜堿、可溶性蛋白質(zhì)等積累,維持細(xì)胞內(nèi)低滲透勢來減輕鹽堿脅迫對植物的傷害[32]。

鹽堿引發(fā)的pH影響著葉片中酶的活性,同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉促使抗氧化酶基因AtAPX3和OsAPX4表達(dá)量上升,降低土壤pH對抗氧化酶(包括SOD、POD及CAT)活性的影響,緩解氧化應(yīng)激對植物細(xì)胞造成的傷害[33]。這在本研究結(jié)果中也得到了生理水平的證實。根瘤菌可以通過調(diào)節(jié)植物的有機(jī)酸含量來減小鹽堿對植物的傷害,AMF還通過吸收K+排出Na+、Cl-,增加葉片相對含水量,降低細(xì)胞膜滲透性等多種方式來參與調(diào)控植物緩解鹽脅迫的機(jī)制[34-36]。不同因素對POD和可溶性蛋白的影響程度不同,這種差異可能是由于兩種菌和鹽堿離子的交互作用產(chǎn)生的。Zhang等[37]發(fā)現(xiàn)堿脅迫會導(dǎo)致雜交榛中Zn、B和Ca含量的降低,使細(xì)胞伸長和分裂受到抑制、細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低,這也是鹽堿脅迫抑制植物生長的另一個因素。高濃度鹽堿脅迫下,植物菌根侵染率下降, Na+積累[38]。幼葉通過光合作用可以維持低Na+和高K+含量,老葉通過加強(qiáng)氨基酸(如纈氨酸、絲氨酸、氨基丁酸等)的合成來進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)及維持細(xì)胞穩(wěn)定[39],但比較緩慢滯后。大多數(shù)植物在NaCl溶液濃度達(dá)到150 mmol/L時就不能存活[40-41],而本實驗中150 mmol/L混合鹽堿脅迫未有植株死亡,這可能與植株的品種基因有關(guān),但也說明了接菌處理增強(qiáng)了紫花苜蓿對鹽堿溶液的抗性,3種接種方式都有利于紫花苜蓿抵抗鹽堿脅迫,但從總體來看,雙接種>單接摩西管柄囊霉>單接根瘤菌。這與相關(guān)研究結(jié)果一致[42]。“AMF+根瘤菌-紫花苜蓿-鹽堿地”體系對提高紫花苜?？果}堿性,有效利用鹽堿地及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有一定的重要意義。

4 結(jié)論

(1) 紫花苜蓿接種根瘤菌或/和摩西管柄囊霉后對鹽堿脅迫(鹽濃度<75 mmol/L,pH 7.0—9.79)耐受性提高,但根瘤菌或/和摩西管柄囊霉的促進(jìn)作用不能完全抵消鹽堿脅迫(鹽濃度100—50 mmol/L,pH 9.87—10.52)對植物的抑制作用。鹽堿脅迫對地上生物量、地下生物量、莖高凈增長量、MDA、脯氨酸及可溶性蛋白的影響要大于摩西管柄囊霉和根瘤菌。

(2) 紫花苜蓿同時接種根瘤菌和摩西管柄囊霉對其株高、生物量及滲透調(diào)節(jié)能力都有所提高,且這種作用優(yōu)于單接一種菌。不同接種方式對植物的影響程度為摩西管柄囊霉+根瘤菌>摩西管柄囊霉>根瘤菌。

(3)鹽堿混合脅迫對紫花苜蓿的生長發(fā)育造成嚴(yán)重傷害,且其傷害程度要大于鹽脅迫。鹽堿脅迫引發(fā)的pH對植物的傷害要大于鹽堿類型,接種根瘤菌和 AMF后的紫花苜蓿不僅有利于自身產(chǎn)量的提高,還能有效利用鹽堿地。