西葫蘆9－順式－環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶CpNCED2基因的克隆及其干旱響應(yīng)模式研究

劉建汀 曾美娟 溫文旭 王 彬 陳敏氡 葉新如 朱海生 溫慶放

(福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013)

西葫蘆(Cucurbita pepoL.) 為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucurbita)一年蔓生草本植物，染色體組型為2n ＝2x ＝40。西葫蘆生長(zhǎng)周期短，耐儲(chǔ)運(yùn)，含有較多的維生素C、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有除煩止渴、潤(rùn)肺止咳等功效，是我國(guó)冬春季節(jié)設(shè)施栽培主要蔬菜種類之一。生產(chǎn)過(guò)程中，連續(xù)高溫天氣容易形成干旱環(huán)境脅迫，影響西葫蘆生長(zhǎng)發(fā)育、水分代謝、抗氧化系統(tǒng)平衡以及光合作用等，導(dǎo)致其產(chǎn)量嚴(yán)重下降[1－2]。持續(xù)的干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致葉片中的脫落酸(abscisic acid，ABA)迅速增多，引起氣孔關(guān)閉，造成葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度及胞間CO2濃度等光合指標(biāo)下降，光合作用能力降低[3]。目前西葫蘆干旱脅迫相關(guān)的研究主要集中在生理生化水平[4－5]，但仍不清楚西葫蘆對(duì)干旱響應(yīng)的生理機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理。

9－順式－環(huán)氧類胡蘿卜素加雙氧酶蛋白(9-cisepoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是內(nèi)源ABA 合成的限速酶，在植物體中以基因家族的形式存在，其表達(dá)量的變化常與ABA 的含量密切相關(guān)[6－8]。研究表明，響應(yīng)干旱等逆境脅迫能夠誘導(dǎo)NCED的表達(dá)從而調(diào)控內(nèi)源ABA 合成[9－11]?；ㄉ?Arachis hypogaea)在干旱脅迫條件下，隨著內(nèi)源ABA 含量的明顯增加，AhNCED1 基因表達(dá)量顯著上調(diào)，將AhNCED1 基因轉(zhuǎn)化至擬南芥突變體(129B08/nced3) 后，擬南芥中AhNCED1 基因超量表達(dá)，可恢復(fù)其在干旱脅迫下ABA的積累進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥抗干旱能力[12]。小麥(Triticum aesivum)中TaNCED基因受ABA、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和干旱脅迫顯著上調(diào)表達(dá)，將TaNCED基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可以提高其對(duì)干旱脅迫的耐受性[13]。在NCED基因響應(yīng)玉米[14]、擬南芥[15]、柑橘[16]和百脈根[17]等植物干旱脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可以誘導(dǎo)NCED基因表達(dá)和內(nèi)源ABA的積累，且在一定范圍內(nèi)，該基因表達(dá)與ABA 積累會(huì)隨干旱時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，表明NCED基因在提高植物抗旱能力方面具有重要作用。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于西葫蘆NCED基因克隆和功能分析的報(bào)道較少[18－19]。本研究前期在田間育種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)1 個(gè)對(duì)干旱脅迫較為敏感的西葫蘆組合——福美6 號(hào)，并從構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出1 條潛在與ABA 合成相關(guān)的NCED基因全長(zhǎng)序列[20]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬測(cè)定西葫蘆干旱脅迫后葉片光合參數(shù)、水勢(shì)以及ABA 含量的變化，分析西葫蘆NCED的基因序列特征和表達(dá)模式，以期了解西葫蘆NCED基因在干旱脅迫中的作用，為進(jìn)一步揭示西葫蘆干旱脅迫的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

西葫蘆福美6 號(hào)品種由母本M016 和父本F031雜交選育而成。試驗(yàn)選取50 粒飽滿的西葫蘆種子，清洗干凈后用次氯酸鈣溶液(100～200 mL·L－1)消毒10 min，用清水洗凈殘留的次氯酸鈣，于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院福清東張基地蔬菜育苗大棚內(nèi)，播種于50 孔穴盤(pán)中，托盤(pán)(28×54 規(guī)格)中每天澆水量為1 L。待西葫蘆幼苗生長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)期，選取生長(zhǎng)良好、大小均一的幼苗停止供水進(jìn)行干旱處理(0、1、2、3 和4 d)，于每日上午9:00 測(cè)定葉片的水勢(shì)、光合參數(shù)，每個(gè)處理3次重復(fù)。采集葉片立即用液氮速凍，－80℃保存，共采集5 組材料，15 個(gè)樣品，用于后續(xù)ABA 含量測(cè)定和熒光定量PCR 試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)試劑

TaqDNA Polymerase、dNTPs、pMD18-T simple 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，HiScript?ⅡSelect RT SuperMix for qPCR (＋gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，基因擴(kuò)增試劑盒Phanta Max Master Mix、熒光定量試劑盒ChangesQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix、DL2000 plus DNA marker 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，通用植物總RNA 提取試劑盒購(gòu)于北京百泰克公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega 公司，其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純或分析純級(jí)。

1.3 基因生物信息學(xué)分析

使用 DNAMAN Version 9 軟件和 ProtParam(https:/ /web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用Prabi 在線軟件(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/)對(duì)蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用Wolf Psort 在線軟件(https:/ /www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；使用SWISS-MODEL(https:/ /swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行蛋白模板比對(duì)，spdbv 軟件構(gòu)建該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，VMD 軟件進(jìn)行蛋白模型呈現(xiàn)；利用MEGA 7 軟件最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，1 000 次重復(fù)。

1.4 西葫蘆CpNCED2 基因克隆

參考試劑盒說(shuō)明提取西葫蘆樣品的總RNA 及合成cDNA 第一鏈。參考前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序庫(kù)中搜索到的NCED基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框架(open reading frame，ORF)全長(zhǎng)克隆引物，正向擴(kuò)增引物CpNCED2-F:GCTTCTTCCCCTTCTCCTCCTTGTCTCG 和反向擴(kuò)增引物CpNCED2-R:TCTGGAAAAGGCACCACAACAAAA TAAG，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、純化、回收后，pMD18-T 載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，PCR 檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 基因定量引物設(shè)計(jì)及分析

采用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https:/ /sg.idtdna.com)設(shè)計(jì)基因CpNCED2-Fq:5′-ACCATCAATGACGGCTCT -3′，CpNCED2-Rq:5′-ACTCCGGTTCCCTTCTTAT-3′，并使用本研究前期克隆獲得的CpActin作為西葫蘆熒光定量PCR 內(nèi)參基因[20－21]。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制25 μL 的反應(yīng)體系，在QuantStudio 7 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系:2 μL cDNA 模板，10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL 正向引物CpNCED2-Fq (10 μmol·L－1)，0.4 μL 反向引物CpNCED2-Rq (10 μmol·L－1)，加ddH2O 至25 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。以上反應(yīng)均重復(fù)3 次。在Excel 軟件中采用2－ΔΔCt法分析處理數(shù)據(jù)并得出目的基因的表達(dá)情況。

1.6 西葫蘆光合參數(shù)及葉片水勢(shì)的測(cè)量

利用GFS 3000 光合測(cè)量?jī)x(WALZ，德國(guó))測(cè)量西葫蘆葉片光系統(tǒng)Ⅱ最大量子效率(maximal quantum efficiency of photosystem Ⅱ，F(xiàn)v/Fm)、凈光合速率(net photosynthesis，Pn)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)( nonphotochemical quenching，NPQ)和光化學(xué)電子傳遞效率(electron transfer efficiency，ETR)4 個(gè)光合指標(biāo)。測(cè)量程序:首先將西葫蘆葉片暗適應(yīng)30 min，然后使用飽和脈沖光(12 000 μmol·m－2·s－1)測(cè)量暗適應(yīng)后葉片的最大熒光(Fm)；在葉片恢復(fù)正常光照10 min(800 μmol·m－2·s－1，光飽和點(diǎn))后分別測(cè)定光合參數(shù)Fv/Fm、Pn、NPQ 和ETR，3 次重復(fù)。葉片水勢(shì)的測(cè)量采用小葉流法，測(cè)定時(shí)間為早上9:00 左右，每個(gè)處理測(cè)定10 片。

1.7 西葫蘆葉片ABA 含量的測(cè)定

參考Xiao 等[22]的方法。試驗(yàn)基于AB Sciex QTRAP 6500 LC-MS/MS 平臺(tái)進(jìn)行:利用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(mass spectrometry，MS/MS)對(duì)所有樣本ABA 進(jìn)行定性定量分析并采集數(shù)據(jù)；分別配制0.5、1、5、10、50 和100 ng·mL－1不同濃度的ABA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)，繪制ABA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線；將檢測(cè)到的所有樣本ABA的積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，得到實(shí)際樣本中ABA 的絕對(duì)含量。按照公式計(jì)算ABA 含量:

ABA 含量(ng·g－1)＝B*C/100/D

式中，B 為樣本中激素積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值，ng·mL－1；C 為復(fù)溶時(shí)所用溶液的體積，μL；D 為稱取的樣本質(zhì)量，g。

利用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件中單因素方差分析法對(duì)上述基因表達(dá)、葉片水勢(shì)、光合參數(shù)以及ABA 含量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西葫蘆CpNCED2 基因的獲得

前期對(duì)西葫蘆葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得25.5 Gb 有效數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝和拼接得到高質(zhì)量的Unigenes 序列83 650 條(序列平均長(zhǎng)度為722.16 nt)，其中Nr 注釋獲得12 893 條Unigene，并從中篩選(條件為E 值<10－5)得到一條全長(zhǎng)為1 941 bp 的cDNA 序列，包含1個(gè)完整的ORF 和47 bp、127 bp 的上游和下游非編碼區(qū)[23－24](圖1)。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因序列與NCBI已公布的中國(guó)南瓜(Cucurbita moschata，XM _023070380.1，E 值為0) 的核酸序列相似性高達(dá)98.15%，通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增基因ORF 全長(zhǎng)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，將該基因命名為CpNCED2(圖2)。

圖1 西葫蘆CpNCED2 基因全長(zhǎng)序列及其編碼的蛋白分析Fig.1 Full-length sequence of the CpNCED2 gene of Cucurbita pepo and its encoded protein analysis

圖2 CpNCED2 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplified product of CpNCED2 gene

2.2 基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1CpNCED2 基因及其編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析序列分析表明，CpNCED2 基因cDNA 全長(zhǎng)1 941 bp，ORF 為1 767 bp，分子式C2946H4556N814O861S18。利用EditSeq 5.01 和ProtParam 軟件對(duì)西葫蘆CpNCED2和中國(guó)南瓜、印度南瓜、絲瓜、甜瓜、黃瓜、葡萄和可可編碼同源蛋白的組成成分及理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表1)。結(jié)果表明，這些植物中NCED 蛋白的氨基酸殘基數(shù)為588～613 個(gè)，理論相對(duì)分子質(zhì)量為65.73～68.71 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.66～8.23。CpNCED2 基因編碼蛋白的堿性氨基酸數(shù)略多于酸性氨基酸數(shù)，脂肪族氨基酸數(shù)明顯多于芳香族氨基酸數(shù)。不同植物NCED 中氨基酸理化性質(zhì)較為一致，存在的差異可能與蛋白非保守區(qū)域的氨基酸差異有關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)總平均疏水性(grand average of hydropacthicity，GRAVY)為－0.3 左右，均屬親水性蛋白質(zhì)。

表1 不同植物來(lái)源NCED 的氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid of NCED from different plant species

2.2.2 CpNCED2 蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 西葫蘆CpNCED2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該序列中α－螺旋結(jié)構(gòu)占比20.27%、β－折疊占比7.31%、β－轉(zhuǎn)角占比72.62%(圖3-A)。該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3-B 所示，模型RF(ramachandran favoured)值為91.05%。

圖3 CpNCED2 蛋白二級(jí)(A)和三級(jí)(B)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary(A) and tertiary(B)structure of CpNCED2

2.2.3 CpNCED2 蛋白的同源比對(duì)與進(jìn)化分析 將西葫蘆編碼氨基酸序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物NCED 序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明西葫蘆CpNCED2(XP_023543156.1)與其他物種NCED 序列具有較高的同源性，其中與中國(guó)南瓜(XP_022926148.1)、印度南瓜(XP_022978939.1)、絲瓜(APO14274.1)、香瓜(XP_008439625.1)和黃瓜(XP_004134911.1)蛋白序列相似度較高，分別為99%、99%、85%、85%和84%，具有高度的保守性。Pfam 分析發(fā)現(xiàn)，CpNCED2 氨基酸序列含有4 個(gè)保守組氨酸位點(diǎn)(His284、His333、His398和His575)和2 個(gè)NCED 蛋白保守結(jié)構(gòu)域(281～289和333～340 位)(圖4)。

圖4 CpNCED2 與其他物種中的同源蛋白的多重比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of CpNCED2 with other homologous sequences

對(duì)西葫蘆和15 個(gè)物種的NCED 序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，西葫蘆NCED 與甜瓜、黃瓜和絲瓜等葫蘆科作物的NCED 蛋白同聚一類，親源關(guān)系較近，與巴西橡膠樹(shù)、木薯和麻風(fēng)樹(shù)等大戟科的NCED 蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，聚類結(jié)果與植物系統(tǒng)分類一致(圖5)。

圖5 NCED 蛋白分子進(jìn)化分析Fig.5 Molecular phylogenetic analysis of NCED protein

2.3 干旱條件對(duì)西葫蘆葉片光合特性的影響

采用小葉流法測(cè)定了西葫蘆葉片中的水勢(shì)變化，由圖6可知，隨著干旱脅迫的產(chǎn)生，西葫蘆葉片的水勢(shì)在停止?jié)菜?、1、2、3、4 d 逐漸降低，并達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。

圖6 干旱脅迫下西葫蘆葉片水勢(shì)變化Fig.6 The water potential changes in Cucurbita pepo leaves under drought stress

光合參數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，干旱脅迫后1、2、3、4 d西葫蘆葉片的Pn、Fv/Fm、NPQ 以及RTR 呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，并達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，表明干旱脅迫后葉片的光合作用能力明顯下調(diào)(圖7)。

圖7 干旱脅迫對(duì)西葫蘆葉片光合特性的影響Fig.7 Determination of photosynthetic parameters of Cucurbita pepo under drought stress

2.4 干旱脅迫下西葫蘆葉片中的ABA 含量變化

通過(guò)配置6 種不同濃度梯度ABA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)信號(hào)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng·mL－1)為橫坐標(biāo)，外標(biāo)/內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y＝0.039 19x－0.001 80(相關(guān)系數(shù)R＝0.997 43，權(quán)重＝1/x)(圖8)。

圖8 ABA 測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard curve of ABA measurement

設(shè)定2.00E－01 和1 000 ng·g－1作為定量上限和下限，將西葫蘆干旱處理(0、1、2、3、4 d)葉片ABA 的峰值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算得到ABA 的絕對(duì)含量。結(jié)果表明，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，西葫蘆葉片中的ABA 含量逐漸升高，并達(dá)到了顯著差異水平(P<0.05)(圖9)。

圖9 干旱脅迫條件下西葫蘆葉片ABA 含量的變化Fig.9 The ABA content of Cucurbita pepo leaves under drought stress

2.5 CpNCED2 基因在西葫蘆干旱脅迫中的表達(dá)分析

熒光定量PCR 分析結(jié)果表明，伴隨西葫蘆干旱脅迫的產(chǎn)生，CpNCED2 基因在停止?jié)菜?、1、2、3 和4 d 呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，1、2、3 和4 d 的表達(dá)量均高于0 d，基因表達(dá)量在3 d 時(shí)達(dá)到最高，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到8 倍左右，達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)(圖10)。

圖10 干旱脅迫下西葫蘆CpNCED2 的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of CpNCED2 in Cucurbita pepo under drought stress

3 討論

NCED基因在1997年首先從玉米ABA 缺失突變體viviparousl4(vpl4)中分離鑒定出來(lái)[14]，隨后從菜豆[25]、鱷梨[26]、擬南芥[27]、草莓[28]和蘋(píng)果[10]等物種中被陸續(xù)克隆出來(lái)。目前，GenBank 上已經(jīng)登錄了西葫蘆NCED基因家族片段，但國(guó)內(nèi)外對(duì)于西葫蘆NCED基因克隆和功能分析的研究報(bào)道較少。本研究從前期西葫蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到1 條全長(zhǎng)為1 941 bp 的cDNA 序列，與南瓜中NCED 的核酸序列相似性達(dá)到98.15%，包含1 個(gè)1 767 bp 的ORF，基因編碼蛋白在Nr 中的功能注釋為NCED(E 值為0)。同源性分析表明，西葫蘆CpNCED2 與同為葫蘆科的中國(guó)南瓜、印度南瓜和絲瓜等的NCED 蛋白序列具有很高的同源性，相似性均在85%以上，表明NCED 蛋白在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，西葫蘆CpNCED2 與甜瓜和黃瓜等葫蘆科作物的NCED 蛋白親源關(guān)系較近，聚為一類，與巴西橡膠樹(shù)、木薯和麻風(fēng)樹(shù)等大戟科的NCED 蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。對(duì)CpNCED2 蛋白進(jìn)行BLASTp 和Pfam 分析發(fā)現(xiàn)，CpNCED2 具有2 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，含有4 個(gè)保守組氨酸位點(diǎn)和2 個(gè)NCED 蛋白保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的RPE65 超級(jí)家族，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白在葉綠體中[29]，表明CpNCED2 蛋白主要在葉綠體中起作用[30]。

葉片是植物光合作用的重要場(chǎng)所，水分的缺乏對(duì)其光合作用具有重要影響。研究表明，長(zhǎng)期干旱脅迫顯著降低辣椒、黃瓜等作物葉片中葉綠素含量，使其氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、天線色素捕光效率(Fv/Fm)以及光合作用關(guān)鍵酶RuBP 羧化酶活性明顯下降，減緩淀粉等糖類物質(zhì)運(yùn)輸，形成對(duì)光合作用反饋調(diào)節(jié)，從而顯著降低Pn，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育[31－33]。Ors 等[34]通過(guò)減少正常澆水量的67%對(duì)西葫蘆幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)25 d 后葉片蒸騰速率(Tr)、Gs、Pn 和植株鮮重分別下降62%、62%、69%和63%。Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 等光合參數(shù)可作為衡量西葫蘆葉片干旱脅迫程度的重要指標(biāo)[35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著西葫蘆干旱脅迫產(chǎn)生，停水處理0、1、2、3、4 d 后葉片中水勢(shì)逐漸降低，其葉片中相應(yīng)的光合指標(biāo)Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 也呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，表明干旱脅迫對(duì)西葫蘆葉片光系統(tǒng)造成了嚴(yán)重破壞，并導(dǎo)致葉片光合作用能力下降。

前人研究表明，ABA 對(duì)于植物迅速、有效地響應(yīng)逆境脅迫具有重要作用，是干旱脅迫應(yīng)答基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成。NCED 是植物ABA 生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶，該基因的表達(dá)模式直接影響ABA 代謝合成，從而影響植物抵抗干旱等環(huán)境脅迫能力。植物中NCED基因能夠響應(yīng)干旱脅迫的產(chǎn)生，快速形成上調(diào)表達(dá)模式，與干旱程度顯著相關(guān)。馬鈴薯(Solanum tuberosum)中[36]，StNCED1 表達(dá)量在干旱脅迫后表現(xiàn)出先降低后升高趨勢(shì)。糜子(P.miliaceumvar.compactrm)中[29]，PmNCED1 的表達(dá)量隨著PEG 脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而升高。水稻(Oryza sativa)中[37]，OsNCED3基因的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，復(fù)水處理后其表達(dá)快速下調(diào)。本研究結(jié)果表明，伴隨西葫蘆葉片干旱脅迫的產(chǎn)生，其體內(nèi)ABA 含量顯著升高，CpNCED2 基因在停止?jié)菜?～4 d 內(nèi)呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，3 d時(shí)上調(diào)倍數(shù)達(dá)到8 倍左右，ABA 含量和CpNCED2 基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致。CpNCED2 基因在4 d時(shí)出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，可能由于干旱脅迫后造成嚴(yán)重缺水，西葫蘆葉片過(guò)度萎蔫，其中細(xì)胞內(nèi)酶活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)mRNA 含量降低而引起總體基因表達(dá)量下降。綜上所述，推測(cè)CpNCED2 基因能夠快速響應(yīng)干旱脅迫的產(chǎn)生，并在西葫蘆葉片ABA 合成過(guò)程中起著重要調(diào)控作用，但相關(guān)研究結(jié)果還需要做進(jìn)一步功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究從西葫蘆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出一條CpNCED2 基因，其全長(zhǎng)1 941 bp，編碼蛋白與中國(guó)南瓜和印度南瓜同源性均高達(dá)99%，具有高度的保守性。CpNCED2 編碼的蛋白含有4 個(gè)保守組氨酸位點(diǎn)和2 個(gè)NCED 蛋白保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的NCED家族基因。分析發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，西葫蘆葉片中水勢(shì)逐漸降低，Pn、Fv/Fm、NPQ 和ETR 等葉片光合指標(biāo)顯著下降，ABA 含量逐漸升高，CpNCED2 基因呈顯著上調(diào)表達(dá)。因此，推測(cè)CpNCED2 基因在西葫蘆干旱脅迫應(yīng)答以及ABA 代謝合成過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。