湘云鯽飼料中磷酸二氫鈣的適宜添加量

王 雙 羅 莉* 石亞慶 唐 毅 李戰(zhàn)福 李偉龍 羅 浩

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716；2.新希望畜牧科技有限公司，成都610041)

磷是魚(yú)類維持正常生長(zhǎng)和骨骼沉積所必需的常量礦物元素之一[1]，是骨組織和鱗片的主要結(jié)構(gòu)成分之一，同時(shí)也是細(xì)胞膜、核酸ATP和磷酸肌酸的重要組分，參與所有產(chǎn)生能量的胞內(nèi)反應(yīng)[2]。魚(yú)類可以在水中直接吸收磷，但由于水體磷含量和魚(yú)類對(duì)飼料原料磷的利用率均較低[3]，因此，配合飼料中需要補(bǔ)充磷以滿足魚(yú)體需求。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚(yú)類對(duì)磷需求量的研究已有大量報(bào)道，因魚(yú)類品種、規(guī)格大小以及飼料配方的差異，魚(yú)類磷需求量表現(xiàn)出較大差異[4-5]，主要淡水養(yǎng)殖品種的磷需要量為0.50%～1.57%，飼料中磷酸二氫鈣(MCP)的添加量為1.4%～3.6%[6-10]。湘云鯽是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，近年來(lái)，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展不斷促進(jìn)其良種的優(yōu)化[11]，在生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、耐低溫、耐低氧、食性廣等方面優(yōu)點(diǎn)突出，已在我國(guó)廣泛養(yǎng)殖。隨著湘云鯽生長(zhǎng)性能的提高，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的需求量隨之發(fā)生變化，但由于實(shí)用飼料配方中的蛋白質(zhì)飼料、能量飼料和無(wú)機(jī)磷源的有效磷參數(shù)并不全面，湘云鯽飼料中對(duì)磷的添加存在不科學(xué)和不確定性。對(duì)于無(wú)胃的鯉科魚(yú)類，MCP是最為高效和經(jīng)濟(jì)的磷源?；诖?，本試驗(yàn)擬在湘云鯽飼料中分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的MCP，探討其對(duì)湘云鯽生長(zhǎng)、消化、抗氧化及脂質(zhì)代謝的影響，確定湘云鯽飼料中MCP的適宜添加量，為湘云鯽飼料的合理配制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)采用魚(yú)粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕作為蛋白質(zhì)源,羅非魚(yú)油作為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料。

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以MCP為磷源，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的MCP，經(jīng)微晶纖維素調(diào)平，配制6種試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料全部過(guò)40目篩，混合擠壓制成直徑為2.0 mm的顆粒料，風(fēng)干分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及其營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets:Fe 150 mg，Cu 3.2 mg，Zn 34.1 mg，Mn 13.0 mg，I 5.7 mg，Se 0.3 mg，Co 12.4 mg，VA 2 000.0 IU，VD 2 000.0 IU，VE 100.0 mg，VK310.0 mg，VB15.0 mg，VB210.0 mg，煙酸 niacin acid 100.0 mg，VB610.0 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 40.0 mg，葉酸 folic acid 5.0 mg，VB120.02 mg，生物素 biotin 1.0 mg，VC 300 mg。

2)實(shí)測(cè)值 Measured values。

1.2 試驗(yàn)魚(yú)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自重慶北碚歇馬魚(yú)種場(chǎng)，經(jīng)濃度為3%的食鹽水消毒后在室內(nèi)循環(huán)水族箱(392 L)中暫養(yǎng)，以商品飼料馴化10 d。正式試驗(yàn)前，選擇體質(zhì)健壯、個(gè)體均勻[初始體重為(40.00±0.34) g]的湘云鯽360尾，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)20尾。每天投喂3次(08:00、12:00、17:00)，日投喂量為體重的3%～5%。根據(jù)試驗(yàn)魚(yú)的增重情況，每隔10 d調(diào)整1次投喂量。每天最后1次投喂2 h后，100%換水1次，正式試驗(yàn)持續(xù)8周。養(yǎng)殖期間水溫22～28 ℃，溶解氧濃度>6.0 mg/L，氨氮濃度<0.10 mg/L，pH 6.6～7.0，亞硝酸鹽濃度<0.10 mg/L。

1.3 樣品采集、制備

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)魚(yú)禁食24 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選8尾魚(yú)，用適量的MS-222麻醉，稱重并測(cè)定其體長(zhǎng)、體高后，選取其中3尾魚(yú)，用紗布擦干尾部，使用1 mL一次性無(wú)菌注射器尾靜脈采血，常溫靜置3 h后，4 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取血清于-80 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)測(cè)定。將采血后的湘云鯽解剖獲得內(nèi)臟團(tuán)，用于測(cè)定內(nèi)臟粗脂肪含量，剩余部分用微波爐加熱至魚(yú)體熟化后，分離脊柱、干燥，用于測(cè)定脊椎骨磷含量。另外的5尾魚(yú)在冰盤(pán)中進(jìn)行解剖，取背部白肌用于測(cè)定肌肉粗脂肪含量，取內(nèi)臟團(tuán)并分離出肝臟、腸道，用濾紙吸干表面水分。所有樣品經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃保存。

所得的肝臟、腸道樣品中，將3尾魚(yú)的肝臟、腸道分別剪碎混勻后，按照1∶9(質(zhì)量體積比，g/mL)加入生理鹽水(4 ℃)，冰浴勻漿，3 500 r/min(4 ℃)離心10 min，上清液即為粗酶液，用于肝臟和腸道指標(biāo)的測(cè)定；另外2尾魚(yú)的肝臟剪碎混勻后用于測(cè)定肝臟粗脂肪含量。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算公式如下：

增重率(WGR，%)=100×(Wt-W0)/W0；飼料系數(shù)(FCR)=F/(Wt-W0)；

式中：W0為魚(yú)體初始尾均重(g)；Wt為魚(yú)體終末尾均重(g)；F為尾均攝食量(g)。

常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定：水分含量采用恒溫干燥法(105 ℃)測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定，粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏半微量蒸餾定氮法測(cè)定，粗灰分含量采用高溫灼燒法(550 ℃)測(cè)定，磷含量采用鉬黃比色法(GB/T 6437—2002)測(cè)定。

肝臟和腸道指標(biāo)以及血清生化指標(biāo)測(cè)定：腸道淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)、胰蛋白酶(trypsin)活性，肝臟丙二醛(MDA)含量，血清超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(AKP)活性及甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、鈣和磷含量均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著性，顯著水平為P<0.05，并用二次模型和折線模型[12]分別對(duì)WGR、FCR、全魚(yú)和脊椎骨磷含量與飼料MCP添加量進(jìn)行回歸分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，隨飼料中MCP添加量的增加，湘云鯽的終末均重、WGR均呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在MCP添加量為2.5%時(shí)達(dá)到最高值，與1.0%組相比，2.5%組的終末均重、WGR分別升高了15.62%、29.90%(P<0.05)。而FCR則反之，隨飼料中MCP添加量的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，在MCP添加量為3.0%時(shí)達(dá)到最低值，與1.0%組相比降低了16.05%(P<0.05)。

表2 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽生長(zhǎng)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

以飼料MCP添加量(X)為自變量，分別以湘云鯽WGR(Y1)和FCR(Y2)為因變量進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y1=-12.246X2+62.479X+57.164(R2=0.971 0，極值為2.55%)，Y2=0.093 6X2-0.484 5X+1.999 9(R2=0.925 7，極值為2.59%)，經(jīng)極值分析得到飼料中滿足湘云鯽最佳生長(zhǎng)需求的MCP添加量為2.55%～2.59%。

2.2 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表3可知，隨著飼料中MCP添加量的增加，全魚(yú)粗蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最高值，顯著高于其他各組(P<0.05)；全魚(yú)粗脂肪含量則呈先下降后上升的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最低值，顯著低于其他各組(P<0.05)，與1.0%組相比下降了15.67%。隨著飼料中MCP添加量的增加，全魚(yú)和脊椎骨磷含量先逐漸上升后保持穩(wěn)定，2.5%組與3.0%和3.5%組相比差異不顯著(P>0.05)；肌肉、內(nèi)臟和肝臟粗脂肪

含量則呈先下降后上升的趨勢(shì)，均在2.5%組達(dá)到最低值，顯著低于其他各組(P<0.05)，較1.0%組分別下降了39.10%、25.98%、22.86%。肌肉和肝臟粗脂肪含量在3.5%組達(dá)到最高值，較1.0%組分別增加了14.6%和15.6%(P<0.05)。

表3 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

以全魚(yú)和脊椎骨磷含量(Y3和Y4)為觀測(cè)指標(biāo)，經(jīng)折線模型分析得到回歸方程：Y3=0.254X+1.173(X≤2.63，R2=0.987 4)，Y3=1.84(X>2.63)，在MCP添加量為2.63%時(shí)全魚(yú)磷含量達(dá)到最高值；Y4=0.228X+7.241(X≤2.71，R2=0.952 8)，Y4=7.86(X>2.71)，在MCP添加量為2.71%時(shí)脊椎骨磷含量達(dá)到最高值。經(jīng)極值分析得到湘云鯽獲得較佳的全魚(yú)和脊椎骨磷含量時(shí)，飼料中MCP的添加量為2.63%～2.71%。

2.3 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，飼料中MCP添加量對(duì)血清鈣含量的影響不顯著(P>0.05)。當(dāng)飼料中MCP添加量從1.0%增加至3.5%時(shí)，血清AKP活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最高值，較1.0%組上升了48.3%(P<0.05)。當(dāng)飼料中MCP添加量從1.0%增加至2.5%時(shí)，血清磷含量呈逐漸升高的趨勢(shì)，各組間差異顯著(P<0.05)；而當(dāng)MCP添加量從2.5%增加至3.5%時(shí)血清磷含量趨于穩(wěn)定，各組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽腸道消化酶活性及血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

由表5可知，當(dāng)飼料中MCP添加量從1.0%增加至3.5%時(shí)，腸道淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最高值，較1.0%組分別升高了93.33%、95.44%和39.79%，差異顯著(P<0.05)，其中淀粉酶及脂肪酶活性的升高幅度高于胰蛋白酶。飼料中MCP添加量對(duì)血清CHO含量沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。當(dāng)飼料中MCP添加量從1.0%增加至3.5%時(shí)，血清TG含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最低值，較1.0%組下降了28.1%(P<0.05)。

表4 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽血清生化指標(biāo)的影響

表5 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽腸道消化酶活性及血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

2.5 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，當(dāng)飼料中MCP添加量從1.0%增加至3.5%時(shí)，血清SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最高值，顯著高于其他各組(P<

0.05)，與1.0%組相比升高了23.26%；而肝臟MDA含量則呈相反的變化趨勢(shì)，在2.5%組達(dá)到最低值，顯著低于其他各組(P<0.05)，與1.0%組相比降低了37.40%。

表6 飼料中MCP添加量對(duì)湘云鯽抗氧化指標(biāo)的影響

2.6 部分指標(biāo)與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性分析

由表7可知，選取WGR代表生長(zhǎng)性能，隨著飼料中MCP添加量的不斷變化，全魚(yú)、內(nèi)臟、肌肉和肝臟粗脂肪含量與湘云鯽的WGR呈顯著二次曲線相關(guān)(P<0.05)，血清AKP、SOD活性及腸道淀粉酶和脂肪酶活性均與湘云鯽的WGR存在顯著的正相關(guān)(P<0.05)，而肝臟MDA含量及血清TG含量均與湘云鯽的WGR存在顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表7 所選指標(biāo)與WGR的相關(guān)性分析

3 討 論

磷是魚(yú)類所需的重要元素，飼料中添加適量的磷能夠提高魚(yú)類的生長(zhǎng)和對(duì)飼料的利用。磷添加量過(guò)多不僅會(huì)造成魚(yú)類代謝紊亂，還會(huì)增加飼料成本，污染水體，但添加量過(guò)低又會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)速率、飼料利用率下降和骨骼畸形。本研究結(jié)果顯示，磷添加量過(guò)低還表現(xiàn)在體脂肪和組織脂肪蓄積、消化能力下降以及機(jī)體抗氧化能力降低等，但未出現(xiàn)骨骼發(fā)育異常等缺乏癥狀，這可能是低添加量(1.0%)的MCP已經(jīng)滿足了湘云鯽對(duì)磷的基本需求。評(píng)價(jià)魚(yú)類飼料中磷適宜添加量的指標(biāo)很多，并且不同的指標(biāo)評(píng)定出的結(jié)果有所差異。本研究根據(jù)試驗(yàn)條件，選取WGR、全魚(yú)和脊椎骨磷含量為參數(shù)，綜合評(píng)價(jià)得出湘云鯽飼料中MCP的適宜添加量。以WGR為觀測(cè)指標(biāo)，湘云鯽飼料中MCP添加量2.55%時(shí)可滿足湘云鯽的最佳生長(zhǎng)。以全魚(yú)和脊椎骨磷含量為觀測(cè)指標(biāo)，折線模型分析后得知飼料中滿足湘云鯽對(duì)全魚(yú)和脊椎骨最大磷沉積量需要的最低MCP添加量分別為2.63%和2.71%。綜上，湘云鯽飼料中適宜的MCP添加量為2.55%～2.71%，即總磷含量為1.40%～1.44%。這一結(jié)果與羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[13]、史氏鱘(Acipenserschrenckii)[8]、齊口裂腹魚(yú)(Sclizothoraxprenanti)[14]的研究結(jié)果相近，但是高于鯽魚(yú)(Carassiusauratus)[15]、建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[16]和胭脂魚(yú)(Myxocyprinusasiaticus)[17]的研究結(jié)果。不同魚(yú)類磷需要量的差異可能是因種類、規(guī)格、生長(zhǎng)階段、飼料配方、磷源以及養(yǎng)殖環(huán)境等不同造成的[18]。消化酶在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其活性大小直接反映魚(yú)類的消化能力[19]。從本試驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)可知，飼料中添加適量的MCP能顯著提高湘云鯽腸道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性，其中2.5%組脂肪酶活性與1.0%組相比增加幅度高達(dá)95.44%，這表明適宜添加量的MCP顯著促進(jìn)了湘云鯽對(duì)飼料的消化能力，提高了其對(duì)飼料的利用效率。

魚(yú)類的生長(zhǎng)還歸因于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的沉積，特別是蛋白質(zhì)和脂肪的沉積。研究表明，飼料中添加適量的磷可顯著提高全魚(yú)粗蛋白質(zhì)含量，同時(shí)促進(jìn)脂肪代謝，降低全魚(yú)粗脂肪含量[10,20]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，飼料中添加適量的MCP可顯著提高湘云鯽全魚(yú)粗蛋白質(zhì)含量，降低全魚(yú)、肌肉和肝臟粗脂肪含量，與適量磷(2.5% MCP)組相比，低磷(1.0% MCP)和高磷(3.5% MCP)組肝臟粗脂肪含量分別增加了29.6%和50.0%，可能的原因是適量MCP的添加促進(jìn)了氧化磷酸化反應(yīng)，使檸檬酸循環(huán)加強(qiáng)，引起乙酰輔酶A加速被利用，魚(yú)體利用更多的脂肪作為能量來(lái)源，磷供應(yīng)不足或過(guò)高都可能抑制這一過(guò)程。此外，飼料中添加適量的2.5% MCP還可顯著降低血清TG含量。綜上所述，飼料中添加適量的MCP可降低肝臟脂肪的合成速率，從而導(dǎo)致魚(yú)體和各組織粗脂肪含量降低，深入的機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

關(guān)于磷對(duì)動(dòng)物抗氧化能力的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。Feng等[21]在建鯉上的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的磷能提高血液SOD活性，同時(shí)降低血液MDA含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，湘云鯽飼料中添加適量的MCP能顯著提高血清SOD活性，降低肝臟MDA含量，與上述結(jié)論一致。此外，Tang等[22]在鯰魚(yú)的研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的磷能顯著提高肝臟SOD活性。其原因與磷是構(gòu)成細(xì)胞膜磷脂的主要成分，飼料中添加適量的磷能保證細(xì)胞膜的完整性，降低一些超氧化物的侵襲[23]相關(guān)。飼料中添加適量的磷可提高湘云鯽的抗氧化能力也是提高湘云鯽生長(zhǎng)性能的原因之一。

4 結(jié) 論

以WGR、FCR、全魚(yú)和脊椎骨磷含量為觀測(cè)指標(biāo)，得出湘云鯽飼料中MCP的適宜添加量為2.55%～2.71%，該添加量的MCP能降低湘云鯽肝臟脂肪合成能力，減少魚(yú)體脂肪沉積，增強(qiáng)消化和抗氧化能力，提高生長(zhǎng)性能。