酶輔助水蒸氣蒸餾法提取興安落葉松針葉精油工藝

徐興堂，張子東，王玉紅

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學研究所，黑龍江 帶嶺 153106 ;2.東北林業(yè)大學 森林植物生態(tài)學教育部重點試驗室，哈爾濱 150040)

松科落葉松屬落葉松〔Larixgmelinii(Rupr.) Kuzen〕是我國東北林區(qū)的主要森林樹種，分布于大、小興安嶺海拔300～1 200m地帶，蘇聯(lián)遠東地區(qū)也有分布，葉為倒披針狀條形(針葉)，富含精油[1]。植物精油是植物新陳代謝的此生產(chǎn)物，可以通過水蒸氣蒸餾法蒸餾等方法提取。松針是對松科常綠喬木針葉的統(tǒng)稱，可提取出精油。松針精油具有清香、果香、木香、藥草香，且具有抑菌、殺蟲等生物活性。

1 試驗材料、儀器及試劑

興安落葉松鮮針葉( 采集自黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)東山種子園)，纖維素內(nèi)切酶(濟寧和信技術有限公司)，纖維素外切酶(濟寧和信技術有限公司)，半纖維素酶(Sigma ，USA)，電子控溫，浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)，電子控溫加熱套(天津泰斯特儀器有限公司)，磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)，三重四極桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent Technologies，USA)，紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)，無水硫酸鈉(天津恒興化學試劑有限公司)，氫氧化鈉(天津致遠化學試劑有限公司)，冰醋酸(天津致遠化學試劑有限公司)，無水乙醇(天津天力化學試劑有限公司)，羥甲基纖維素鈉(CMC)(天津致遠化學試劑有限公司)，葡萄糖標準品(Sigma，USA)，3，5-硝基水楊酸(DNS試劑)(上海季藍生物有限公司)，酒石酸鉀鈉 (天津市光復科技發(fā)展有限公司)，結晶酚(天津天力化學試劑有限公司)，醋酸鈉(天津致遠化學試劑有限公司)。

2 試驗方法

2.1 酶活測定

吸取稀釋酶液(吸取1.0mL酶液，精確到0.01mL，準確稀釋定容)與1.8mL 1%的CMC溶液加入具塞刻度試管混勻，50℃水浴加熱60min，水浴加熱完成后取出待其冷卻，加入DNS試劑2mL，搖勻后立即沸水浴加熱10min，冷卻后用蒸餾水定容至25mL；稀釋酶液中加入1.8mL醋酸緩沖溶液，不加入CMC其他步驟同上，作為空白用于調(diào)零，550nm下測OD值。平行3次測定取其平均值，代入葡萄糖標準曲線的回歸方程得出含量，按式1計算酶活(U/g)[2]。

式1中：5.56為1mg葡萄糖的μmol數(shù)。

2.2 原料酶預處理及精油的提取

取100g自然干燥后粉碎的興安落葉松針葉放入2 000mL的蒸餾燒瓶中，按料液比1∶10加入蒸餾水，分為5組。5組分別為添加100U半纖維素酶組，纖維素內(nèi)切酶組，纖維素外切酶組，混合酶(半纖維素∶纖維素外切酶=1∶1)組及不添加任何酶組的對照空白組。將裝好的蒸餾燒瓶固定在50℃的恒溫水浴鍋中，攪拌60 min后，進行水蒸氣蒸餾提取，即加熱至沸騰開始計時120min。獲得的精油冷卻至室溫，記錄體積。將精油裝入密封的玻璃瓶中，4℃保存，備用。進行3次重復試驗，計算興安落葉松針葉精油得率。

2.3 興安落葉松針葉精油氣相質(zhì)譜(GC-MS)分析方法

安捷倫7000A三重四極桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀氣相條件：色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛細管柱，進樣口溫度280℃，初始柱溫50℃，以3℃/min升至140℃，保持10min，以15℃/min升至215℃，以5℃/min升至260℃，保持2min。載氣為高純氦氣，分流比為40∶1，進樣量1μL。電子轟擊離子源(EI)溫度：230℃，接口溫度280℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍30～500aum，溶劑延遲時間為3.75min。

2.4 酶輔助提取興安落葉松針葉精油

經(jīng)上述試驗計算得到的不同酶預處理后提取興安落葉松針葉精油的得率，其最大值所對應的酶用于單因素試驗。酶解時間、酶解溫度和pH值是酶解過程中的重要因素，因此對其進行單因素試驗，確定酶解反應的最佳條件。

2.4.1 酶解pH值。將100U的酶溶于pH分別為3、4、5、6的1 000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于50℃水浴鍋中進行酶預處理60 min，間歇攪拌。酶解后進行水蒸氣蒸餾提取，120 min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3 500 r/min離心10 min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計算興安落葉松針葉精油得率，確定最適pH值。

2.4.2 酶解時間。將100U酶溶于pH值為5的1 000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于50℃水浴鍋中進行酶預處理，酶解時間分別選取為30min、60min、90min、120min，間歇攪拌。酶解后進行水蒸氣蒸餾，120min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3 500r/min離心10min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計算興安落葉松針葉精油得率，確定酶解作用時間。

2.4.3 酶解溫度。將100U的酶溶于pH值為5的1000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于30、40、50、60℃的恒溫水浴條件下進行酶預處理90min，間歇攪拌。酶解后進行水蒸氣蒸餾提取，120min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3500r/min離心10min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計算興安落葉松針葉精油得率，確定酶解作用溫度。

3 試驗結果

3.1 酶的活力

對3種酶的酶活力的測定的結果為：半纖維素酶、纖維素外切酶和纖維素內(nèi)切酶的活力分別為2160.28U/g、2432.72U/g和2465.12U/g。

3.2 興安落葉松針葉精油的提取率

表1 不同酶預處理提取興安落葉松針葉精油量

由不同酶預處理提取興安落葉松針葉精油量(表1)可知：經(jīng)酶預處理的精油提取率為1.23%，酶輔助方法提取精油的量明顯增加。不同的酶預處理后提取精油量也有所差異，其中，混合酶的效果最好，提取率為1.70%，比對照提高了38.2%，可見興安落葉松針葉經(jīng)酶預處理后更有利于精油的提取。

3.3 興安落葉松針葉精油成分分析

由不同酶預處理后提取興安落葉松針葉精油的成分及含量(表2)與不同酶預處理后提取興安落葉松針葉精油成分(表3)可知：經(jīng)5種預處理后的興安落葉松針葉精油中被鑒定出33種成分、.其中含量大于1%的主要成分分別有24、23、24、24和24種，含量大于10%的主要成分分別有2、3、2、2和3種；采用峰面積歸一法計算所含各成分的相對含量百分比，精油中大于1%的主要成分89.117%、88.736%、89.752%、89.516%和90.406%。由此可見，酶預處理組與未經(jīng)酶預處理組比較，主要成分相差不大。

表2 不同酶預處理后提取興安落葉松針葉精油的成分及含量

注：A：未經(jīng)酶預處理，B: 經(jīng)半纖維素酶預處理， C：經(jīng)纖維素外切酶預處理， D：經(jīng)纖維素內(nèi)切酶預處理， E：經(jīng)混合酶(纖維素外切酶∶半纖維酶=1∶1)預處理。

表3 酶預處理后的興安落葉松針葉精油中主要成分的種類

注：A：未經(jīng)酶預處理， B：經(jīng)半纖維素酶預處理， C：經(jīng)纖維素外切酶預處理， D：經(jīng)纖維素內(nèi)切酶預處理， E：經(jīng)混合酶(纖維素外切酶∶半纖維酶=1∶1)預處理。

3.4 酶輔助提取興安落葉松針葉精油工藝優(yōu)化

3.4.1 pH值

由pH值對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖1)可知：當pH值=5時，興安落葉松針葉精油得率最高；當pH值<5時，精油得率隨pH值的降低而降低；pH值>5時，精油得率隨pH值的增加而降低。這是由于混合酶的活性受到pH值的影響，pH = 5時混合酶可以最大限度的破環(huán)β-1，4糖苷鍵消溶細胞壁。由于細胞壁的損傷程度逐步提高，有效物質(zhì)溶出阻力降低，故此時興安落葉松針葉精油得率最高。

圖1 pH值對興安落葉松針葉精油得率的影響

3.4.2 酶解作用時間

由酶解時間對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖2)可知：興安落葉松松針的酶解過程90min基本完成，當酶解反應在30～90min時，精油得率明顯上升，而在90min之后，精油得率無太大變化。因此，最佳酶解時間為90min。因酶解反應必須持續(xù)一定的時間，但酶解時間過長可能會導致酶與溶出物發(fā)生了反應或有效成分溶出受到酶解產(chǎn)物的阻礙，而使溶出率降低。

圖2 酶解時間對興安落葉松針葉精油得率的影響

3.4.3 酶解溫度

由酶解溫度對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖3)可知：當溫度<50℃時，精油得率隨著溫度的升高而增加，而當溫度>50℃后，精油得率反而降低。因此，最佳酶解溫度為50℃。由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)大分子化合物，故溫度超過酶解最適溫度范圍就會使酶逐步變性，酶的立體構象與活力位點發(fā)生改變使酶活力的下降或喪失，從而影響混合酶對興安落葉松針葉葉的酶解效果，不利于興安落葉松針葉精油的提取。

圖3 酶解溫度對興安落葉松針葉精油得率的影響

4 結論

4.1 本研究采用酶輔助-水蒸氣蒸餾法提取興安落葉松針葉精油。采用半纖維素、纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及混合酶(纖維素外切酶∶半纖維素酶=1∶1)對興安落葉松針葉預處理后提取其精油，其結果表明：混合酶組預處理后提取精油量最高，經(jīng)酶預處理的興安落葉松針葉精油提取率比未經(jīng)酶預處理組提高了38.2%，這對大規(guī)模工業(yè)化云杉精油的提取意義重大。經(jīng)過GC-MS分析，未經(jīng)酶預處理組與酶預處理組提取的興安落葉松針葉精油，在相同氣質(zhì)條件下，進行分析鑒定，精油組成和主要成分含量未沒有明顯變化，這表明在精油得率提高的同時并未影響精油的品質(zhì)。

4.2 對提取興安落葉松針葉精油的預處理條件進行單因素試驗研究，得到最佳提取工藝條件，當pH值為5、酶解時間為90min、酶解溫度為50℃，興安落葉松針葉精油得率最高，為1.70%。提取工藝條件可靠，并可以為其它植物精油的提取提供新的方法和理論依據(jù)。