七葉樹花揮發(fā)油的GC-MS方法優(yōu)化及β-葡萄糖苷酶對七葉樹花的增香作用

高玉瓊，郭利影，孟憲鑫，張麗娜，楊廣德

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061)

中華七葉樹 (AesculuschinensisBunge)又名七葉樹、婆羅樹、娑羅樹，屬七葉樹科七葉樹屬植物[1]，是一種良好的觀賞樹種，又具有很高的醫(yī)療保健價值。目前，已有報道[2]對七葉樹種子的化學(xué)成分、藥理作用等做了描述，認(rèn)為其主要含有五環(huán)三萜皂苷類化合物及黃酮苷類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等方面的作用。近年來其種子中也分離出了6種新的三萜皂苷，且經(jīng)過毒性試驗(yàn)認(rèn)為其對MCF-7細(xì)胞具有活性抑制作用[3]。同時，尉芹[4]等對七葉樹葉提取物進(jìn)行了抗氧化性能研究，同時初步鑒定出其提取物中含有酚類及鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮類化合物、植物甾醇等活性成分。劉宏偉[5]等從七葉樹樹葉中分離得到了4個化合物：原七葉樹皂苷元、21-當(dāng)歸?；?原七葉樹皂苷元、21β-當(dāng)歸?；?原七葉皂苷配基-3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)][β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)]β-D-吡喃葡萄糖醛酸和異秦皮苷。劉軍生[6]等還從七葉樹的根和莖中分離出了一株具有高產(chǎn)七葉皂苷C的內(nèi)生真菌EA-LIS80，而七葉樹花揮發(fā)油的化學(xué)成分目前尚未報道。為進(jìn)一步探討其花的化學(xué)成分與其種子等的異同，采用了在揮發(fā)性成分測定中使用較為廣泛的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，參考文獻(xiàn)方法[7]對七葉樹花的揮發(fā)油進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜分析。

β-葡萄糖苷酶是一種廣泛存在于生物界的水解酶，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。不僅如此，β-葡萄糖苷酶還能將果蔬及茶葉中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)[8-10]。本實(shí)驗(yàn)利用β-葡萄糖苷酶水解七葉樹的鮮花、干花及干燥花苞，以驗(yàn)證β-葡萄糖苷酶對其是否具有增香作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：新鮮七葉樹花及花苞于2018年5月采自西安交通大學(xué)藥學(xué)院的藥園，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為七葉樹科植物七葉樹(AesculuschinensisBunge)的花。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)；AY120電子天平(日本島津)。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 u/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠，分析純)；檸檬酸(成都化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)。分別稱取2份200g新鮮七葉樹花(或干花或干燥花苞)于500mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.2g β-葡萄糖苷酶，同時置于搖床中50℃恒溫水浴5h。同法制備空白溶液。

1.2.2 揮發(fā)油的提取。200g β-葡萄糖苷酶水解前后的鮮花、干花及干燥花苞，分別進(jìn)行水蒸氣蒸餾，餾液用正己烷萃取，無水硫酸鈉干燥后回收溶劑得揮發(fā)油約0.1g，得率為0.05%。揮發(fā)油為淡黃色透明油狀液體。將提取得到的揮發(fā)油用正己烷溶解并定容至10mL。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的色譜條件篩選。實(shí)驗(yàn)采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)管色譜柱，載氣為He，其它色譜條件進(jìn)行比較篩選后確定。

1.2.3.1 升溫程序：于10mL量瓶中取1mL七葉樹花揮發(fā)油提取物進(jìn)樣，在色譜柱始溫為80℃，保持2min后以10℃/min升溫至110℃，再分別以5℃/min升溫至260、270和280℃，保持2min的條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果表明升溫至280℃為宜。

最終確定升溫程序?yàn)椋褐紲?0℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升溫至280℃，保持2min，可達(dá)到較好分離。

1.2.3.2 分流比：在確定升溫程序后，分別設(shè)定分流比為40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1和直接進(jìn)樣，進(jìn)行分析，結(jié)果顯示分流比的改變會影響出峰時間與峰強(qiáng)度，在對比峰形及峰強(qiáng)之后，確定分流比為5∶1。

1.2.3.3 流速：不同的載氣流速會引起成分出峰時間的改變，故分別于流速為0.6、0.8、1.0 mL/min的條件下進(jìn)樣，結(jié)果顯示當(dāng)流速為0.8 mL/min時其色譜峰分離效果較好。

1.2.3.4 離子源電壓：在6種不同的離子源電壓30、40、50、60、70、80eV下進(jìn)行分析，在70eV時峰強(qiáng)度最大峰形最好，故確定以70eV為宜。

1.2.3.5 離子源溫度：分別于離子源溫度為230、250℃的條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示250℃時峰形較好，峰強(qiáng)較大，故確定以250℃為宜。

1.2.3.6 接口溫度：在2種不同接口溫度250、280℃下進(jìn)行分析，結(jié)果顯示主成分相對含量幾乎無差別，同時參照儀器設(shè)置接口溫度需比離子源溫度高20 ～ 30℃，故確定以280℃為宜。

1.2.3.7 進(jìn)樣口溫度：分別于進(jìn)樣口溫度為260、280、300℃下進(jìn)樣分析，主成分相對含量幾乎無差別，考慮到進(jìn)樣口溫度比樣品分析最高溫度約高20℃，確定以280℃為宜。

通過上述篩選，最終確定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析色譜條件，氣相色譜：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度280℃，接口溫度280℃，載氣為氦氣，流速0.8 mL/min，分流比5∶1。升溫程序：柱始溫80℃，保持2min，以10℃/min速率升到110℃，再以5℃/min升溫至280℃，保持2min。質(zhì)譜：離子源電壓70eV，離子源溫度250℃，進(jìn)樣量1.0μL；質(zhì)量掃描范圍45～550m/z；溶劑峰切除時間為2.5min，質(zhì)譜檢測起測時間為3.0min。質(zhì)譜圖計算機(jī)檢索數(shù)據(jù)庫：NIST譜庫檢索。

2 結(jié)果

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對干燥七葉樹花的揮發(fā)油提取物進(jìn)行分析，其總離子流圖結(jié)果如下：

通過分析比較，確定色譜條件篩選后的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法對色譜峰可以達(dá)到較好的分離。新鮮七葉樹花及干燥花苞的揮發(fā)油提取物也采用同樣方法進(jìn)行測定。通過計算機(jī)譜庫檢索及核對質(zhì)譜圖，鮮花、干花、花苞及酶水解后的鮮花、干花、花苞揮發(fā)油提取物的化學(xué)成分分析見表1。

表1 新鮮、干燥七葉樹花及其干燥花苞的化學(xué)成分分析

注：*代表加β-葡萄糖苷酶組

本次實(shí)驗(yàn)從新鮮七葉樹花的揮發(fā)油提取物中確證了44個化合物，從七葉樹干花的揮發(fā)油提取物中確證了27個化合物，從七葉樹花苞的揮發(fā)油提取物種確證了34個化合物。

由表1可知，在新鮮七葉樹花揮發(fā)油中的含有許多醇類及酸類物質(zhì)，其主要成分為反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(10.34 %)、反式氧化芳樟醇(8.94%)、芳樟醇(8.30%)、鄰二甲苯(7.67%)、棕櫚酸(6.79%)、桃金娘烯醇(5.74%)等。在干燥七葉樹花揮發(fā)油中主要物質(zhì)也含有許多醇類及酸類物質(zhì)，其主要成分為6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(16.10%)、鄰苯二甲酸二丁酯(9.10%)、鄰苯二甲酸酯(8.89%)、壬醛(8.74%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇(7.55%)、庚醛(6.18%)等。在七葉樹花苞揮發(fā)油中主要成分為醇類、其主要成分有有冰片(29.18%)、桃金娘烯醇(5.96%)、植物醇(4.84%)、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇(4.07%)、鄰苯二甲酸二丁酯(3.72%)、花生酸(3.71%)等。

通過表1的對比，可知在鮮花中β-葡萄糖苷酶存在作用。對比可知在加入β-葡萄糖苷酶后棕櫚酸、正十二烷、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮的相對含量分別增加12.99%、4.86%、1.39%，增長率達(dá)到191.43%、260.44%、32.25%。同時植物醇、反式-橙花叔醇、紫蘇醛、和金歡醇、冰片、雪松醇等物質(zhì)的相對含量也有所增加。同時可以觀察到反式氧化芳樟醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、桃金娘烯醇及反式芳樟醇等物質(zhì)的相對含量出現(xiàn)明顯降低。

干花通過表1比較可知，在干花中加入β-葡萄糖苷酶反應(yīng)，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、異丁香酚、香葉醇、(R)-(+)-β-香茅醇、反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、茉莉酮、苯乙醛的相對含量有所增加，6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、異丁香酚、香葉醇及(R)-(+)-β-香茅醇的增加量較多分別為5.50%、0.59%、0.36%、0.27%，增長率分別達(dá)到了34.14%、62.46%、16.47%、25.27%，干花中其余物質(zhì)含量均下降。

通過對比表1花苞結(jié)果，可知在花苞中加入β-葡萄糖苷酶后部分化合物的含量有所增加，其中棕櫚酸相對含量顯著增加5.24%，增加率達(dá)到174.07%，同時2-異丙基-5-甲基-1-庚醇相對含量增加3.26%，增加率達(dá)到592.59%。還可以觀察到甲基庚烯、(3R,6S)-2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫化吡喃醇、桃金娘烯醇、香葉醇、紫蘇醇、丁香酚、茉莉酮等成分均有所增加，但是其余成分的相對含量均有所減少，其中冰片相對含量出現(xiàn)明顯減少，達(dá)到3.92%。

3 結(jié)論

通過建立并優(yōu)化七葉樹花揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，測定了其鮮花、干花及干燥花苞揮發(fā)油的化學(xué)成分主要以醇類化合物為主，為進(jìn)一步開發(fā)和利用七葉樹資源提供了理論依據(jù)。同時通過對七葉樹花揮發(fā)油的成分分析，可知其含有很多香精類成分，例如桃金娘烯醇、香葉醇、紫蘇醇、丁香酚等，而β-葡萄糖苷酶則可以促進(jìn)鮮花及花苞中這些香精類成分的釋放，且其對花苞的作用強(qiáng)度大于鮮花，這證明了β-葡萄糖苷酶可水解鮮花及花苞的香氣前體物質(zhì)，釋放出鮮花中潛在的香氣成分，但由于β-葡萄糖苷酶的加入，致使某些香精類成分含量有所減少，推測其只能增加七葉樹花中的某些特定成分，而不能使全部香精成分的相對含量增加，故其對七葉樹花的增香作用并不明顯。