超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆粕中有機(jī)磷類藥物殘留量的研究

徐麗佳，張秀芹，劉 笑，苗 翠，郭國(guó)賢，律 瑤

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

有機(jī)磷是用于防治植物病蟲(chóng)害的使用最廣泛的一類廣譜、高效農(nóng)藥，多為磷酸酯類或硫代硫酸酯類。殘留在獸藥和飼料中的有機(jī)磷類農(nóng)藥被動(dòng)物吸收富集后進(jìn)入人類食物鏈，易被人體胃腸道吸收，已有醫(yī)學(xué)報(bào)道證明這類化合物會(huì)引起人類基因突變等疾病，將嚴(yán)重影響人類健康。豆粕是棉籽粕、花生粕等12種動(dòng)植物油粕飼料產(chǎn)品中產(chǎn)量最大，用途最廣的一種，其作為畜牧業(yè)投入品應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品中的濃度高，所以豆粕中的農(nóng)藥殘留，會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響。農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定敵百蟲(chóng)、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)和辛硫磷7種有機(jī)磷類農(nóng)藥在動(dòng)物肌肉中的最高殘留限量（MRL）為20～4000微克/公斤。目前，我國(guó)對(duì)豆粕中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留限量并沒(méi)有明確規(guī)定?，F(xiàn)有的有機(jī)磷殘留分析多采用氣相色譜法及氣相色譜—質(zhì)譜法，方法的抗干擾能力較弱，前處理方法多采用凝膠滲透色譜法凈化，處理過(guò)程繁瑣，耗費(fèi)溶劑。而關(guān)于豆粕中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，現(xiàn)有的方法、文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)均暫未查到。本文采用固相萃取凈化方法，建立了同時(shí)測(cè)定豆粕中敵百蟲(chóng)、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)和辛硫磷7種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。該方法具有溶劑用量少、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜；Metler NE260分析天平；Therom Biofuge 離心機(jī)；JT baker ASEMD 60固相萃取裝置；美國(guó)Organomation公司N-EVAP112氮?dú)獯蹈蓛x；Stuart SA 8渦旋混合器；BUCHI Multivapor P-12旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。Carb/ PSA (500mg/6cc)小柱，waters公司。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：敵百蟲(chóng)、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)、辛硫磷均購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究有限公司（100微克/毫升）。甲醇、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純，丙酮為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

2 方法

2.1 混合對(duì)照品溶液配置

精密量取敵百蟲(chóng)、敵敵畏、馬拉硫磷、巴胺磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)、辛硫磷對(duì)照品1.5毫升，置于10毫升容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為15微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在-20℃下保存，在3個(gè)月內(nèi)使用。分析時(shí)再配制成質(zhì)量濃度為15、25、50、100、150、200納克/毫升的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 樣品前處理方法

稱取均質(zhì)后的豆粕5克(精確到0.01克)于50毫升離心管內(nèi)，加入10.0毫升乙酸乙酯，渦旋混勻，中速振蕩提取5分鐘，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，傾出上清液，重復(fù)提取1次，合并上清液；40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，向旋蒸管中加入5毫升丙酮，渦旋混合3分鐘，作為備用液。

將Carb/PSA復(fù)合萃取柱用3毫升丙酮活化，取全部備用液過(guò)柱，控制流速為1毫升/分鐘，收集流出液，用5毫升丙酮以相同流速洗脫柱子并收集，洗脫液于40℃氮?dú)獯蹈?，殘余物中加入甲醇?.2%甲酸水（50∶50）溶液1.0毫升，充分渦旋混勻后，過(guò)0.2微米微孔濾膜，液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定。

2.3 UPLC條件

色譜柱：B E H C18（100毫米×2.1毫米，1.7 米）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5.0分鐘，50%A線性變化至90%A；5.0～5.1分鐘，90%A線性變化至50%A；5.1～7.0分鐘，維持50%A）；流速：0.3毫升/分鐘；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10微升。

2.4 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓：3.5千伏；源溫：120℃；霧化溫度：350℃；錐孔氣流速：50升/小時(shí)；霧化器流速：650升/小時(shí)。7種有機(jī)磷類藥物的定量定性離子、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見(jiàn)表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法線性

分別精密量取適量的7種有機(jī)磷類藥物混合標(biāo)液，制得濃度為15、25、50、100、150、200納克/毫升系列對(duì)照溶液，從中各取1.0毫升，分別溶解空白組織經(jīng)提取、凈化及濃縮后的殘余物，搖勻，過(guò)0.2微米濾膜后作為基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定。按低濃度到高濃度的順序依次進(jìn)樣，以對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），定量離子對(duì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），求得回歸方程，結(jié)果列于表2。可以看出，7種有機(jī)磷類藥物在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.990。

3.2 方法靈敏度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在勻漿后未處理的空白樣品中添加7種有機(jī)磷類藥物，按“2.2”項(xiàng)下方法處理和檢測(cè)，依據(jù)色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測(cè)限，S/N＞10為方法定量限，得出7種有機(jī)磷類藥物的檢測(cè)限為3微克/公斤，定量限為5微克/公斤。空白豆粕樣品中添加14微克/公斤7種有機(jī)磷類藥物的色譜圖示于圖1。

圖1 空白豆粕樣品中添加14微克/公斤7種有機(jī)磷類藥物的色譜圖

3.3 方法的回收率與樣品檢測(cè)結(jié)果

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在勻漿后的未處理的空白樣品中添加7.0、14.0、24.0微克/公斤3個(gè)不同濃度7種有機(jī)磷類藥物，按“2.2”處理和檢測(cè)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每批次進(jìn)行6個(gè)樣品的平行試驗(yàn)，得出7種有機(jī)磷類藥物在3種添加濃度的回收率范圍為67.6%～97.8%，批內(nèi)RSD范圍為0.5%～9.7%，批間RSD范圍為3.4%～16.5%，均小于20%，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)，對(duì)來(lái)自遼寧省內(nèi)不同廠家的30個(gè)飼料豆粕實(shí)際樣品，按“2.2”處理和檢測(cè)，測(cè)得的實(shí)測(cè)樣品中7種有機(jī)磷類藥物均為未檢出。

表2 7種有機(jī)磷類藥物校正曲線

表3 7種有機(jī)磷類藥物在不同濃度加標(biāo)回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

3.4 色譜條件的建立

考察了甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-10毫摩乙酸銨溶液兩種流動(dòng)相對(duì)分析效果的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-0.2%甲酸水為流動(dòng)相時(shí)，有機(jī)磷農(nóng)藥的離子化效果較好，靈敏度高，采用梯度洗脫的方式，7種有機(jī)磷藥物分離度較好。

3.5 質(zhì)譜檢測(cè)方法的建立

常用的質(zhì)譜電離源有ESI源、APCI源和APPI等，摸索質(zhì)譜條件時(shí)，以不同的錐孔電壓進(jìn)行正負(fù)離子掃描，發(fā)現(xiàn)7種有機(jī)磷農(nóng)藥均在正離子模式下響應(yīng)較好。采用較高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定各種藥物的準(zhǔn)分子離子，然后以準(zhǔn)分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，獲得二級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)的子離子，最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行采集。

3.6 樣品前處理

有機(jī)磷農(nóng)藥是親酯性化合物，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。植物性產(chǎn)品主要用于二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等極性較大的溶劑進(jìn)行提取。本文比較了乙腈、乙酸乙酯和乙酸乙酯：正己烷（9∶1）三種溶劑的提取效果，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，用乙酸乙酯的提取效果最好，提取液干凈、雜質(zhì)少。固相萃取方法具有省時(shí)、省溶劑、操作安全、重復(fù)性好的特點(diǎn)，常用的有機(jī)磷藥物的固相萃取柱主要有活性炭萃取柱、C18反相固相萃取柱和Carb/NH2（碳黑/氨基）復(fù)合萃取柱。本文選取Carb/PSA復(fù)合萃取柱，凈化效果好，回收率較高，能有效去除樣品中的雜質(zhì)干擾。因此，本文采用乙酸乙酯提取，提取液濃縮后，丙酮溶解，固相萃取凈化。

圖2 7種有機(jī)磷農(nóng)藥在不同提取液中提取回收率

4 結(jié)論

本法采用提取和固相萃取前處理技術(shù)，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法建立了7種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定和確證方法。本方法具有良好的線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度、回收率和滿意的定量限以及分離效果。目前我國(guó)暫無(wú)明確規(guī)定豆粕中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留限度，通過(guò)對(duì)實(shí)際豆粕樣品檢測(cè)，得出該方法適用于檢測(cè)豆粕樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥的殘留量，從而為控制豆粕中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留提供有效檢測(cè)方法。