miR-362促進非小細胞肺癌放療加速再增殖的研究

朱魯程 張仕蓉 夏冰 馬勝林

目前，放射治療（以下簡稱放療）是肺癌綜合治療的重要組成部分，約60%～70%的肺癌患者在病情的不同階段需要接受放療。隨著影像和放療技術的不斷進步，臨床上對于無法手術的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期以及局限的Ⅳ期肺癌患者，放療更是作為一種主要的根治性手段而廣泛應用。對于多處轉移的Ⅳ期肺癌患者，近年來出現(xiàn)的靶向藥物和免疫治療也為其帶來了更長的生存時間，這也為放療在這部分人群中的應用提供了更多的臨床空間。然而，常規(guī)劑量（50～70Gy）放療后，約 40%～50%的肺癌患者會出現(xiàn)局部病灶未控或復發(fā)[1]。放療后殘存病灶是導致放療失敗的主要原因[2]。放療過程中，由于受到組織增殖動力學及細胞周期的影響，腫瘤細胞受到照射后會在放療后期出現(xiàn)增殖加速的現(xiàn)象，稱之為加速再增殖。從臨床資料來看，腫瘤開始加速再增殖的時間是腫瘤體積開始退縮之前，也就是放療開始后的2～4周。了解放療后腫瘤加速再增殖的具體分子機制，對于進一步優(yōu)化放療方案，提高腫瘤控制率具有重要的臨床意義。因此，本研究通過建立非小細胞肺癌放療加速再增殖模型，在此基礎上從分子水平探討小分子RNA中的miR-362介導加速再增殖效應的相關機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌H1975細胞株購自美國ATCC細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA（0.25%）胰蛋白酶、FBS、青霉素-鏈霉素抗生素購自美國Gibco公司。TaqMan RNA逆轉錄試劑盒購自美國ABI公司，SYBR Green PCR master mix試劑購自美國Roche公司。miR-362、GAPDH引物序列均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H1975細胞株使用PRMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞倍增時間決定傳代時間，當細胞長滿瓶底的80%時，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）進行消化傳代。傳代后一般每隔1d換液1次，選擇對數(shù)生長期的細胞作為實驗對象。

1.2.2 H1975.luc熒光細胞建立 以螢火蟲熒光素酶報道質粒pGL4.19為模板PCR擴增得到FLUC片段，PCR產(chǎn)物電泳后回收特異片段與載體pHRSIN-CSGWDINotI連接。PCR鑒定后制備重組質粒并進行測序。293T細胞種至6孔板。慢病毒表達質粒、包裝質粒及無血清培養(yǎng)基混合5min再與Lipo2000混合20min后形成DNA-Lipofectamine混合物?；旌衔锛拥酱?93T接種的6孔板中，轉染后4℃ 500g離心15min，過濾上清液，再經(jīng)4℃8 000g離心16h后去上清液獲得慢病毒。H1975細胞與慢病毒轉染，72h后加嘌呤霉素篩選，常規(guī)傳代并維持嘌呤霉素篩選，直至100%細胞表達熒光蛋白，此時細胞即為H1975.luc細胞。梯度接種H1975.luc細胞至96孔板檢測熒光強度與細胞數(shù)目的線性關系。

1.2.3 熒光檢測 根據(jù)實驗要求將H1975.luc細胞鋪于96孔或6孔培養(yǎng)板中，加入和培養(yǎng)液等量檢測試劑，等待2min使細胞完全裂解，Molecular SpectraMax M3多功能酶標儀檢測生物熒光強度。

1.2.4 miRNA芯片檢測 委托上海吉凱基因化學技術有限公司進行檢測及后續(xù)分析。利用miRNA芯片比較經(jīng)6Gy X射線照射與未經(jīng)照射處理的H1975細胞中miRNAs的表達情況。

1.2.5 PCR檢測 采用Trizol提取細胞總RNA，并按TaqMan RNA逆轉錄試劑盒說明書將5ng的總RNA逆轉錄合成cDNA。在ABI 7500實時熒光定量PCR儀中，使用SYBR Green PCR master mix試劑，以GADPH作為內參，量化miR-362的表達水平。選取的引物如下：miR-362正向引物 5′-GTCACGAAATCCTTGGAACCTAG-3′， 反 向 引 物 5′-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3′；GAPDH 正向引物 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，反向引物 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，使用 2-ΔΔCt方法定量，計算miR-362的相對表達水平。

1.2.6 細胞轉染 將H1975細胞分為3組，空白對照組（H1975細胞）、陰性對照組（H1975-NC細胞，即H1975細胞轉染空載體）及miR362基因敲除組（H1975-miR362KD細胞，即H1975細胞轉染miR-362基因敲除載體）。經(jīng)PLKO.1慢病毒穩(wěn)定轉染H1975細胞，構建經(jīng)慢病毒穩(wěn)定轉染的H1975-miR362KD細胞株。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關分析采用Pearson相關；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 H1975.luc細胞特征分析 分析形態(tài)學上H1975.luc細胞未見明顯改變，顯微鏡下與H1975細胞對比未見明顯不同。H1975.luc細胞倍增時間為（36.7±4.3）h，H1975細胞倍增時間為（34.9±3.7）h，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩種細胞生長曲線相似。流式細胞檢測 H1975.luc細胞 G0/G1、S、G2/M 期分別占 （52.29±1.10）、（35.12±0.94）、（12.59±1.17）%；H1975 細胞 G0/G1、S、G2/M 期分別占（52.85±1.43）、（35.65±1.61）、（11.50±1.06）%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 H1975.luc細胞數(shù)量與熒光強度的關系 選擇100/500/1 000/5 000/10 000個H1975.luc細胞接種到96孔板后檢測熒光強度，結果顯示H1975.luc細胞數(shù)量與熒光強度成線性正相關（r=0.995，P＜0.05）（圖1）。

圖1 H1975.luc細胞數(shù)量與熒光強度散點圖

2.3 非小細胞肺癌放療加速再增殖模型建立 將5 000個普通H1975細胞接受不同劑量（2～8Gy）照射，將照射后的細胞與500個H1975.luc細胞共培養(yǎng)7～14d，測定熒光強度變化，根據(jù)熒光強度評估不同放射劑量下加速再增殖發(fā)生情況，結果顯示放射后H1975細胞能夠促進周邊未照射H1975.luc細胞的增殖，并且這一作用一定程度上隨放射劑量增加而加大（圖2）。

2.4 照射前后H1975細胞miRNA表達情況比較利用miRNA芯片比較了經(jīng)6Gy放射與未經(jīng)放射處理H1975細胞中miRNAs的表達情況，其中miR-362在放射處理后的細胞中表達上調。PCR檢測也發(fā)現(xiàn)與放射處理的H1975細胞共培養(yǎng)的H1975細胞miR-362表達明顯上調。

2.5 基因敲除驗證miR-362介導加速再增殖 經(jīng)慢病毒穩(wěn)定轉染的H1975-miR362KD細胞株miR-362表達明顯下調（P＜0.05）（圖3）。6Gy放射后的H1975細胞、經(jīng)miR-362穩(wěn)定敲除H1975-miR362KD細胞分別與H1975.luc細胞共培養(yǎng)，相較于H1975細胞組，H1975-miR362KD組細胞熒光強度明顯減弱，同時PCR檢測也發(fā)現(xiàn)與H1975-miR362KD細胞共培養(yǎng)的H1975細胞miR-362表達明顯下調（圖4）。

圖2 不同放射劑量處理的H1975細胞與H1975.luc細胞共培養(yǎng)10d熒光強度情況

圖3 H1975、H1975-NC及 H1975-miR362KD細胞 miR-362表達情況比較

圖4 經(jīng)6Gy放射處理H1975細胞、H1975-miR362KD細胞分別與H1975.luc細胞共培養(yǎng)后熒光強度比較

3 討論

盡管幾十年來臨床一直強調應重視腫瘤加速再增殖，但目前對腫瘤加速再增殖，尤其是腫瘤放療加速再增殖的機制尚未完全清楚。細胞周期、DNA損傷修復機制和蛋白調節(jié)等多種信號通路可能與加速再增殖有關[3-4]。電離輻射能夠激活表皮生長因子受體和具有酪氨酸激酶活性的ErbB家族的其它因子，導致MAPK通路的激活，由此刺激腫瘤細胞再增殖[5]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡相關蛋白caspase 3不僅在細胞凋亡過程中扮演重要角色，而且能夠活化與其結合的蛋白，通過caspase 3/iPLA2/PGE2信號通路，促進腫瘤細胞再增殖[6]。放療能夠上調血小板活化因子受體，調節(jié)腫瘤微環(huán)境及改變腫瘤巨噬細胞表型促進細胞再增殖[7]。

本研究通過經(jīng)熒光素酶標記的非小細胞肺癌H1975.luc細胞建立了肺癌加速再增殖模型，接著將一定數(shù)量接受不同放射劑量照射后的H1975細胞與未接受放療的H1975.luc細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后細胞熒光強度明顯增加，并且在0～8Gy內隨放療劑量的增加而加大，這也提示加速再增殖現(xiàn)象的存在。當然，輻射旁效應與加速再增殖有著類似的途徑，最主要的區(qū)別在于加速再增殖多發(fā)生在放療的后期。本研究團隊通過前期實驗發(fā)現(xiàn)單次照射后繼續(xù)共培養(yǎng)7～14d才能觀察到加速再增殖現(xiàn)象；而輻射旁效應通常發(fā)生在照射后數(shù)小時內。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)A549細胞接受5Gy照射后的輻射旁效應由磷酸化AKT介導，15min內磷酸化AKT達到最高，在60min后則迅速下降。腫瘤加速再增殖過程中許多信號轉導通路都發(fā)生了改變，那么又是什么引起了這些改變呢？

小分子物質，尤其是miRNAs對腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中關鍵蛋白的轉錄及翻譯起了非常重要的作用。miRNAs是生物體內普遍存在且進化上高度保守的一類非編碼小分子RNA，其通過與靶基因3′端非編碼區(qū)發(fā)生不完全配對，從而調節(jié)靶基因mRNA的轉錄和翻譯過程，參與轉錄后基因表達調控，參與細胞的增殖分化和凋亡等生理活動，miRNAs在特定器官、組織中調控作用的異?；蛉笔Э赡軐е略撈鞴侔l(fā)生惡性轉化甚至癌變以及其它相關生理進程的紊亂，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。研究已經(jīng)證實，miRNAs在放療引起基因表達、細胞信號及DNA損傷修復中發(fā)揮著重要作用[11]。例如miR-34a通過直接結合RAD51以降低其表達從而調控同源重組DNA損傷修復，阻礙放射后的非小細胞肺癌細胞系的DNA雙鏈損傷修復[12]；miR-15/16a直接與TLR1結合后下調NF-κB通路提高非小細胞肺癌細胞的放射敏感性[13]。

然而，關于miRNAs是否在腫瘤加速再增殖中發(fā)揮重要作用以及具體機制尚缺乏。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-193a通過調控TGF-β2/TGF-βRⅢ信號通路促進胰腺癌細胞放療后再增殖[14]。本研究利用miRNA芯片比較了經(jīng)6Gy放射與未經(jīng)放射處理細胞中miRNAs的表達情況，其中miR-362在放射處理后的細胞中表達上調；進一步PCR檢測也發(fā)現(xiàn)與放射處理組共培養(yǎng)的細胞miR-362表達明顯升高。有報道稱，miR-362能夠促進胃癌細胞增殖、抑制凋亡，并能激活NF-κB及其下游基因、抑制抑癌基因CYLD[15]；另一項研究顯示miR-362通過靶向CYLD促進肝癌細胞生長和轉移[16]；在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)抑制miR-362能抑制細胞增殖和轉移，敲除miR-362導致G1期阻滯及細胞凋亡[17]。為進一步了解miR-362功能情況，本研究將H1975細胞miR-362敲除后再次接受6Gy放射后與細胞共培養(yǎng)；相較于H1975細胞組，H1975-miR362KD組細胞熒光強度明顯減少，同時PCR也發(fā)現(xiàn)與H1975-miR362KD組細胞中miR-362表達明顯下降。因此，筆者認為放療引起的miR-362的高表達可能介導了腫瘤加速再增殖。

隨著對細胞外miRNAs來源的探討，越來越多的研究認為外泌體可能是細胞外miRNAs的重要載體。腫瘤細胞分泌的外泌體可以被其它腫瘤細胞攝取并改變靶細胞狀態(tài)，通過分泌外泌體將一些信號分子分泌到其它組織或細胞中參與調控作用[18-19]。本研究團隊后續(xù)將從外泌體入手，深入探討腫瘤放療加速再增殖的機制。

綜上所述，本研究成功建立了非小細胞肺癌放療加速再增殖模型，觀察到了不同放射劑量處理后肺癌細胞的加速再增殖效應，其效應或與miR-362的高表達介導有關。當然，進一步探索和理解背后潛在的具體分子機制，尚需要更多后續(xù)研究。