百合磷莖中Regaloside A、Acetylregaloside C與Regaloside B高速逆流色譜分離及生物活性研究

陸 英，劉仲華，肖文軍，傅冬和，謝紅旗，曾建國

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，湖南 長沙 410128)

百合(Liliaceae)是多年生草本植物，全世界約有90多種，我國約有46種18個變種，其中卷丹(LiliumlancifoliumThunb)、百合(LiliumbrowniiF.E.Brown var．viridulumBaker)或細(xì)葉百合(L.pumilumDC.)的干燥肉質(zhì)鱗莖是我國藥典中記載的藥用品種，也是民間廣泛使用的藥食同源植物?！吨腥A人民共和國藥典》中所載百合的功效為養(yǎng)陰清肺、清心安神?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為百合“主邪氣腹脹、心痛。利大小便，補中益氣”?！侗静菔觥分杏涊d，“百合之功，在益氣而兼之利氣”。現(xiàn)代藥理研究表明，百合在抗抑郁[1]、抗腫瘤[2]、降血糖[3]、抗氧化[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等方面具有很好的療效。百合中除富含對人體有益的營養(yǎng)元素外，研究人員還從不同品種的百合磷莖及地上部分分離出酚酸甘油酯苷、酚酸甘油酯、甾體皂苷、生物堿、甘油苷、黃酮等多種化學(xué)成分[6-13]?，F(xiàn)代藥理研究也逐步闡釋并挖掘百合的傳統(tǒng)功效，但由于百合中化學(xué)成分制備繁瑣復(fù)雜，重現(xiàn)性差，目前對其藥理研究集中于有效部位、有效總成分，對單體化合物活性的研究很少，功能物質(zhì)有待進一步闡明。2015 年版《中華人民共和國藥典》也僅通過性狀和薄層鑒別來控制百合質(zhì)量，缺乏有效成分的量化標(biāo)準(zhǔn)。

高速逆流色譜(HSCCC)是近年來發(fā)展的一種液-液分配色譜技術(shù)，具有操作簡便、重現(xiàn)性好、制備量大的特點，廣泛用于天然活性物質(zhì)的制備[14-15]。Luo等[14]以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.05%三氟乙酸水(3∶5∶3∶5，體積比)為溶劑結(jié)合HSCCC技術(shù)從卷丹百合中分離得到7個酚酸甘油酯化合物，并對其體外抗氧化作用做了初步研究。然而，由于品種不同，卷丹百合與百合在化學(xué)成分上有一定差異，本文建立了HSCCC分離百合(LiliumbrowniiF.E.Brown var．viridulumBaker)中3個酚酸甘油酯苷化合物的方法，并對化合物的抗氧化性及其對豬胰α-淀粉酶活性的影響進行了初步研究，首次發(fā)現(xiàn)此3種化合物對α-淀粉酶活性有一定的促進作用，該結(jié)果可為進一步研究百合的消食益氣功能提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TBE-300A型高速逆流色譜儀(內(nèi)徑1.6 mm，柱容積280 mL，上海同田生化技術(shù)有限公司)；LC-20 A高效液相色譜儀(日本島津公司)；721紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；MODULYOD-230冷凍干燥機(美國熱電公司)；AUW220D電子天平(日本島津公司)。

甲醇(色譜純，美國天地公司)；乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);乙酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇為食用級;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，東京化成工業(yè)株式會社)；α-淀粉酶(Sigma 公司)。

百合購于湖南省龍山縣(品種為LiliumbrowniiF.E.Brown var．viridulumBaker)，置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎備用。

1.2 高效液相色譜(HPLC)分析條件

采用WondasilTMC18(4.6 mm×250 mm)色譜柱；流動相:A為水，B為甲醇，梯度洗脫程序:0～40 min，20%～80%B；流速1.0 mL/min；柱溫:30 ℃，進樣量20 μL。

1.3 百合磷莖提取物的制備

取830 g干燥百合粉，加入6倍質(zhì)量的60% 乙醇，于60 ℃水浴提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至無醇味(約3 200 mL)。將該提取液以26 mL/min流速通過裝有800 mL D101大孔吸附樹脂的層析柱(4.6 cm×48 cm)。吸附后靜置0.5 h，用1 600 mL蒸餾水淋洗除去雜質(zhì)，再用70%乙醇洗至洗脫液顏色很淺(流速均為26 mL/min)，將乙醇洗脫液(2 900 mL)減壓濃縮至小于200 mL后冷凍干燥，即得百合磷莖過柱提取物6.5 g，置于冰箱中避光保存，作為HSCCC的進樣原料。

1.4 高速逆流色譜(HSCCC)分離過程

按乙酸乙酯-正丁醇-0.5%乙酸水溶液(3∶1.5∶5，體積比)配制溶劑體系，將所有溶劑按體積比充分混合，靜置分層過夜后；將上相與下相分離，超聲脫氣10 min后將上相溶劑以20 mL/min的流速泵入主機管路，待上相溶劑充滿管路后，再以850 r/min 轉(zhuǎn)速正向旋轉(zhuǎn)，柱溫箱25 ℃，將下相以2 mL/min 的流速泵入，檢測波長280 nm。平衡后取“1.3”制備的樣品250 mg，用20 mL下相溶解，進樣，80 min后進行圖譜采集，根據(jù)峰形手動分段收集流出液，減壓濃縮后冷凍干燥，得粉末狀化合物1、2、3。

1.5 化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振(1H NMR 和13C NMR)對3個化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜采用電噴霧電離源ESI，負(fù)離子模式；核磁共振樣品用氘代甲醇(CD3OD)溶解，頻率為400 MHz。

1.6 化合物的生物化學(xué)研究

化合物對DPPH的自由基清除作用研究參照文獻[16]，對脂質(zhì)過氧化抑制作用研究參照文獻[17]，對豬胰α-淀粉酶活性影響的研究參照文獻[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 百合磷莖提取物的HPLC分析

分別考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相對百合乙醇提取液中各組分的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩種體系下，提取液中各主要色譜峰均能獲得滿意的分離且峰形基本一致，綜合溶劑的環(huán)保性能，最終選擇甲醇-水溶液為流動相。在“1.2”分析條件下，百合乙醇提取液的HPLC譜圖見圖1。PDA檢測器顯示，HPLC圖中各色譜峰均具有相似的紫外吸收光譜，且在311 nm左右有最大吸收，在280 nm處有肩峰，其中1、2、3號峰相對較高，確定為分離目標(biāo)組分。

2.2 百合磷莖提取物的制備

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇實驗考察了不同體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%)乙醇對提取效果的影響。結(jié)果表明，60%乙醇對百合磷莖中目標(biāo)化合物的提取效果最佳。

2.2.2HSCCC上樣原料的制備百合磷莖60%乙醇提取液中除目標(biāo)組分外還含有糖、淀粉、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這不僅會降低目標(biāo)組分的含量，還可能在后續(xù)高速逆流分離時造成固定相流失，因此，本實驗采用大孔吸附樹脂吸附目標(biāo)組分，再采用70%乙醇洗脫的方式去除雜質(zhì)，使目標(biāo)組分得到較好的富集。

2.3 HSCCC溶劑體系的選擇及分離效果

HSCCC作為一種液-液分配色譜，可供選擇的溶劑體系比較廣泛，可通過改變?nèi)軇w系實現(xiàn)對不同極性物質(zhì)的分離，因此溶劑體系的選擇對分離效果至關(guān)重要，一般可通過化合物K值確定。目標(biāo)組分具有一定的親水性，實驗考察了親水性較強的溶劑體系乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶1，體系1)、乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶2∶5，體系2)和乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶1.5∶5，體系3)對分離的影響。結(jié)果表明，體系1中化合物1、2的K值太小，體系2 中化合物1、3的K值很接近，難以分開。體系3中加入0.5%乙酸后，對化合物1、2的K值影響不大，但使化合物3的K值增大，經(jīng)HSCCC上機分離后，化合物1、2、3能實現(xiàn)完全分離，因此選擇溶劑體系乙酸乙酯-正丁醇-水(0.5%乙酸，3∶1.5∶5)。

在“1.4”條件下HSCCC分離的色譜圖見圖2，根據(jù)峰形收集得到3個化合物，經(jīng)濃縮、冷凍干燥并進行HPLC分析得到4.2 mg純度為96.2%的化合物1，2.3 mg純度為95.1%的化合物2，5.8 mg純度為98.8%的化合物3(在254 nm波長下采用面積歸一法計算)。HSCCC分離圖譜及HPLC色譜圖見圖2。

2.4 化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

化合物1:淺黃色粉末，MSm/z399.1372[M-H]+；1H NMR(CD3OD):7.45(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2’，6’)，δ7.65(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7’)，6.80(2H，d，J= 8.1 Hz，H-3’，5’)，6.36(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8’)，4.29～3.00(H-1-3，H-1’’-6’’)；13C NMR(CD3OD):δ67.45(C-1)，70.58(C-2)，72.30(C-3)，127.91(C-1’)，132.00(C-2’)，117.60(C-3’)，162.07(C-4’)，117.60(C-5’)，132.00(C-6’)，147.59(C-7’)，115.69(C-8’)，169.95(C-9’)，105.45(C-1’’)，75.85(C-2’’)，78.73(C-3’’)，72.71(C-4’’)，78.63(C-5’’)，63.45(C-6’’)。MS、1H NMR及13C NMR均與文獻[6]相符，確定為:(2S)-1-O-p-coumaroyl-3-O-β-D-glucopyranosylylycerol((2S)-1-O-p-香豆酰-3-β-葡萄糖甘油酯苷，俗名王百合苷A,Regaloside A)，分子式為C18H24O10。

化合物2:黃色粉末，MSm/z457.1442[M-H]-；1H NMR(CD3OD):6.26(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8)，6.77(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J= 1.8，8.0 Hz，H-6)，7.04(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，7.54(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，δ1.95(3H，s，CH3)，4.50～3.19(H-1-3，H-1’’-6’’)；13C NMR(CD3OD):δ75.92(C-1)，64.67(C-2)，78.66(C-3)，127.36(C-1’)，123.85(C-2’)，147.60(C-3’)，150.50(C-4’)，115.92(C-5’)，114.66(C-6’)，148.24(C-7’)，117.27(C-8’)，169.60(C-9’)，172.99(COCH3)，21.77(COCH3)，105.47(C-1’’)，78.66(C-2’’)，75.74(C-3’’)，69.53(C-4’’)，72.28(C-5’’)，63.45(C-6’’)。MS、1H NMR及13C NMR均與文獻[10]相符，確定為:(2S)-1-O-acetyl caffeoyl-3-O-β-D-glucopyranosylylycerol((2S)-1-O-乙?？Х弱?3-O-β-D-葡萄糖甘油酯苷，俗名乙?；醢俸宪誄,Acetylregaloside C)，分子式為C20H26O12。

圖3 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of compounds 1-3

化合物3:淺黃色粉末，MSm/z441.1478[M-H]-；1H NMR(CD3OD):7.30(2H，d，J= 8.9 Hz，H-2’，6’)，δ7.45(1H，d，J= 16.1 Hz，H-7’)，6.63(2H，d，J= 8.9 Hz，H-3’，5’)，6.16(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8’)，4.34～3.00(H-1-3，H-1’’-6’’)，1.85(3H，s,OCH3)；13C NMR(CD3OD):δ69.53(C-1)，75.73(C-2)，64.70(C-3)，173.05(COCH3)，21.77(COCH3)，127.80(C-1’)，132.07(C-2’)，117.62(C-3’)，162.16(C-4’)，117.62(C-5’)，131.07(C-6’)，147.85(C-7’)，115.34(C-8’)，169.63(C-9’)，105.44(C-1’’)，72.82(C-2’’)，78.78(C-3’’)，72.24(C-4’’)，78.66(C-5’’)，63.47(C-6’’)；MS、1H NMR及13C NMR均與文獻[6]相符，確定為(2S)-1-O-p-coumaroyl-2-O-β-D-glucopyranosylylycerol-3-O-acetylglycerol((2S)-1-O-p-香豆酰-2-O-β-D-葡萄糖-3-O-乙酰甘油酯苷，俗名王百合苷B,Regaloside B)，分子式為C20H26O11。

3種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

2.5 化合物的抗氧化活性研究

3種化合物對DPPH自由基的清除作用見表1，化合物1、3對DPPH自由基清除作用很弱，體系中樣品質(zhì)量濃度最大時也僅為14%左右，二者間無顯著差異?；衔?對DPPH自由基清除作用較強，且呈顯著的量效關(guān)系(R2=0.996)，半抑制濃度IC50為27.97 mg/L。陽性對照抗氧化劑VC、化合物2以及化合物1、3間有顯著差異，清除DPPH自由基強弱為:VC>化合物2>化合物1≈化合物3。

表1 化合物對DPPH自由基清除作用(n=3)Table 1 Antioxidative activities of compounds on scaveging DPPH(n=3)

* there is no significant difference in the same letters；there are significant differences between different letters，p<0.01(相同字母表示無顯著性差異；不同字母表示有顯著性差異，p<0.01)

化合物對脂質(zhì)的過氧化抑制作用見表2，化合物1、3對脂質(zhì)過氧化抑制作用無顯著差異，當(dāng)體系樣品濃度進一步增大時其抑制率增加緩慢，樣品濃度最大時也低于50%?；衔?對脂質(zhì)過氧化抑制很強，在實驗最低濃度時即可達到85%左右，在低濃度時與VC有顯著差異，但在高濃度時無顯著差異；化合物1及化合物3在不同濃度下均無顯著性差異。化合物對脂質(zhì)過氧化抑制作用強弱為:化合物2>VC>化合物1≈化合物3。

表2 化合物對脂質(zhì)過氧化抑制作用(n=3)Table 2 Inhibitory effects of compounds on lipid peroxidation(n=3)

* there is no significant difference in the same letters；there are significant differences between different letters，p<0.01(相同字母表示無顯著性差異；不同字母表示有顯著性差異，p<0.01)

文獻[14]對卷丹百合中7個酚酸甘油酯化合物DPPH清除作用的IC50為13～1 265 mg/L，不同化合物之間差異很大，1-O-p-coumaroylglycerol 及1，3-O-di-p-coumaroylglycerol 的活性遠(yuǎn)弱于1-O-caffeoyl-O-p-coumaroylglycerol及1，2-O-p-diferuloylycerol。本研究也表明，香豆?；视王ボ栈衔飳ψ杂汕宄饔眠h(yuǎn)弱于咖啡?；视王ボ铡Ｍ瑫r，化合物對脂質(zhì)的過氧化抑制作用與對自由基清除作用雖然效果不同，但規(guī)律相似，因此可以推測，化合物對脂質(zhì)過氧化的抑制作用與化合物結(jié)構(gòu)中與甘油形成酯的酸相關(guān)，咖啡酸強于對香豆酸。

2.6 化合物對淀粉酶活性的影響

實驗表明，分離的3個化合物對淀粉酶活性具有一定的促進作用。由表3可見，3個化合物在不同濃度時對α-淀粉酶活性有一定的增強作用，但化合物間無顯著性差異。

表3 化合物對淀粉酶的促進作用(n=3)Table 3 Sitmulation of coumpounds on α-amylase(n=3)

* there is no significant difference in the same letters；there are significant differences between different letters，p<0.01(相同字母表示無顯著性差異；不同字母表示有顯著性差異，p<0.01)

3 結(jié) 論

本文以乙酸乙酯-正丁醇-水(0.5%乙酸，3∶1.5∶5)為溶劑體系，通過高速逆流色譜從百合中制備分離得到3個化合物，經(jīng)質(zhì)譜及核磁共振鑒定為酚酸甘油酯苷化合物。對化合物的抗氧化作用和對α-淀粉酶活性影響進行了初步研究，結(jié)果表明，Regaloside A 與Regalside B 對DPPH自由基的清除作用很小，但對脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用；Acetylregaloside C 對自由基清除作用和對脂質(zhì)過氧化作用均較強，推測香豆?；视王ボ栈衔锏目寡趸饔萌跤诳Х弱；视王ボ?。本實驗首次發(fā)現(xiàn)3個化合物對α-淀粉酶活性具有一定的促進作用，但化合物間無顯著差異。研究結(jié)果為中藥百合的藥理研究及質(zhì)量控制中化學(xué)成分的高效穩(wěn)定制備提供了方法。